从"有意回避"到"研发热点" 共价抑制剂的研究进展

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整理 | 小墨

前言

共价抑制剂(targeted covalent inhibitors, TCIs)是一类能够与特定的靶蛋白共价结合，从而抑制其生物功能的小分子化合物。这些抑制剂往往都含有丙烯酰胺、β-内酰胺等官能团，能与靶蛋白中特定的氨基酸残基发生化学反应，形成共价键，从而抑制相应蛋白的生物学功能。

由于共价抑制剂可能存在脱靶带来的副作用，制药业常常有意避免设计共价药物，但依然有许多非常成功、安全和商业化的共价药物被报道开发。最早的共价抑制剂可以追溯到阿司匹林。早在19世纪初，其已经被用来治疗疼痛和发热，而直到20世纪70年代经研究才发现阿司匹林以与丝氨酸残基共价结合的方式不可逆抑制乙酰化环氧合酶。英国医生于20世纪偶然发现的抗生素青霉素也是共价抑制剂，其通过β-内酰胺环不可逆地与青霉素结合蛋白的丝氨酸残基形成共价键，阻止细胞壁合成。最近的一个例子包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2型主要病毒蛋白酶(SARS-CoV-2Mpro)药物nirmatrelvir，FDA已发布了紧急使用授权。该药物使用丁腈弹头与SARS-CoV-2Mpro的催化半胱氨酸145形成共价键。

在过去的10年里，共价药物的临床进展受到了前所未有的关注，并获得了多项批准，有许多综述强调了共价抑制剂在医药领域的重要应用。本视角聚焦于共价抑制剂药物的临床进展。

批准共价药物的发展

图1.小分子药物批准与时间的关系：(A)1673种小分子药物 (B)117种共价药物

自1895年发现最古老的共价药物阿司匹林以来，已有1673种小分子药物获得FDA的批准，其中117种(7%)是共价药物，它们只占药典的小部分。对这两类药物的趋势线分析表明，共价药物的获批比率为所有小分子药物的1/15。这反映出，从历史上看，大多数药物发现计划都会避免共价药物，因为他们相信可逆药物可以达到预期的目标产品类型，并避免潜在的毒性风险。

直到1980年代，许多已获批准的共价药物是抗生素(47%)，这反映了它们通过革命性地改变传染病的治疗而对人类健康产生的巨大影响。在接下来的十年(1990年代)，随着质子泵和抗血小板抑制剂的出现，批准了范围更广的共价药物，这两种药物都成为轰动一时的药物类别。到目前为止，这些药物要么是偶然发现的，要么是基于机制，或者两者兼而有之。21世纪初批准了多种基于共价机制的抑制剂，如丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂，这是治疗丙型肝炎的第一类直接抗病毒药物。此外，这一时期还批准了对血液病治疗产生积极影响的蛋白酶体抑制剂。

靶向共价抑制剂的出现

图2.(A)显示结合可逆药物并通过弹头的特定位置与药物靶标形成结合的TCI方法的示意图。

(B)通过迈克尔加成丙烯酰胺弹头与EGFR共价抑制剂结合并与半胱氨酸797形成键的示意图

在合理设计共价药物过程中，常涉及结合药物化学和生物信息学，以蛋白质家族中的非催化残基为目标，创建特定的共价抑制剂(图2A)。这种方法利用了药物产生的大量可逆小分子，以及从X射线结晶学和核磁共振获得的关于其结合模式的大量结构信息。这些特定的可逆小分子可以利用计算机药物设计和生物信息学进行工程设计，以将弱亲电弹头定位在蛋白质结合位置上半胱氨酸附近。

该方法的第一个例子发表于1997和靶向表皮生长因子受体(EGFR)。它证明了激酶家族中高度保守的三磷酸腺苷位点上的Cys797可以共价靶向，从而使正交策略能够实现效力和选择性(图2B)。这一策略随后在2005年被应用于核糖体S6激酶，证明该方法可以被成功地更广泛地应用。它现在已经被应用于激酶之外的其他家族，以及从小分子跨越到蛋白质治疗领域。

随着时间的发展，靶向氨基酸及共价弹头都得到了较大的发展，代表结构如下表所示：

与可逆药物相比，共价抑制剂药物具有重要的优势。

（1）有利于药物发现。与药物靶标形成键能够通过有利于结合形式而提高效力，从而导致高效的势能和配基效率，这对于发现有效化合物是有价值的。

（2）有机会通过结构生物信息学来创建新的选择性图谱。通过使用结构生物信息学来识别所需目标所特有的亲核性，主要是半胱氨酸。

（3）延长药效。由于靶标被共价修饰所抑制，蛋白质活性的恢复依赖于蛋白质的重新合成，从而导致药物作用时间的延长。这有效地将药物的药效学与药物暴露分离，因为靶向抑制在药物被清除后仍然存在。共价药物的这一特性使给药频率更低，并有可能降低药物剂量。这种药代动力学/药效学的分离还可以最大限度地减少脱靶抑制，从而提高安全性。

图3.化学结构 (*表示共价抑制剂)

自1947年以来共批准了117种共价药物，其中8种是共价抑制剂(图3)。自2013年首次引入共价抑制剂以来，它们占所有已批准的共价药物的7%(8/117)和44%(8/18)。其中，七种获批的共价抑制剂激酶药物有靶向EGFR/突变EGFR [afatinib(Giltrof)和dacomitinib(Vizimpro)]、EGFR/表皮生长因子受体2 (HER2)[neratinib(Neralynx)]、突变EGFR特异性[Osimertinib(Tagrisso)]和BTK [ibrutinib(Imbruvica)、zanubrutinib(Brukinsa)、和acalabrutinib(Calquence)]。第八种KRAS药物sotorasib为靶向点突变体(G12C)，该突变体发生在大约13%的非小细胞肺癌(NSCLC)患者和1%-3%的结直肠癌患者和其他实体瘤患者中。七种激酶药物均与酪氨酸激酶家族的ATP结合位点结合，并靶向半胱氨酸(表1)。每种药物可逆地与药物靶标结合，然后与半胱氨酸硫醇形成永久共价键。相比之下，弹头具有很大的相似性，作为迈克尔受体。

不同靶点的共价抑制剂发现时间表

在过去的十年中，八种共价抑制剂药物已被批准用于治疗肺癌、白血病、淋巴瘤和乳腺癌。

3.1 用于治疗肺癌的EGFR抑制剂

图4.以EGFR为靶点的共价药物发现时间表，共价抑制剂用红色突出显示。

3.2 用于治疗乳腺癌的HER2抑制剂

图5.HER2靶向共价药物发现的时间表，共价抑制剂为红色。

3.3. 用于治疗白血病/淋巴瘤BTK抑制剂

图6.BTK靶向共价药物发现的时间表，共价抑制剂为红色。

3.4. 用于治疗突变型KRAS肿瘤的G12C抑制剂

图7.KRAS共价药物发现时间表，共价抑制剂为红色。

共价抑制剂毒副作用

宿主蛋白的共价修饰可能引发免疫反应，从而导致异质药物毒性 (IDT)，共价药物的发展受到阻碍。肝脏和皮肤是IDT最常见的器官，肝脏毒性是药物退出市场的主要原因。

在具体抑制剂方面，EGFR抑制剂afatinib和dacomitinib以及HER2抑制剂neratinib的主要毒性是皮疹和腹泻。针对野生型EGFR和HER2，皮疹和腹泻是抗体和可逆小分子药物以及共价抑制剂的常见毒性。这表明这些毒性是抑制 EGFR 和HER2信号通路的结果。相对于EGFR抑制剂afatinib或HER2抑制剂neratinib，第三代共价突变选择性EGFR药物 osimertinib的毒性降低也支持了这一点。BTK药物毒性包括感染、出血、腹泻和皮疹。

共价抑制剂的安全性数据跨越了8年，结果令人鼓舞。在过去8年中，超过250 000 名患者服用了药物osimertinib，而在过去6年中，有200 000名患者服用了ibrutinib。这些药物以及其他已获批准的共价抑制剂激酶抑制剂的安全性数据并未显示出相对于比较可逆药物更大的毒性，实际上可能显示出改善的特征。同时，肝毒性对于可逆激酶药物很常见。Paludetto等人表明，在FDA批准的25种可逆酪氨酸激酶药物清单中，60%有肝毒性警告标签，20%有黑框警告。

结果表明，迄今为止批准的共价抑制剂激酶药物似乎没有严重的肝毒性。如果共价激酶药物相对于可逆药物确实具有良好的安全性，这可能是由于母体共价抑制剂药物的谷胱甘肽-S-转移酶解毒机制，通过将谷胱甘肽添加到丙烯酰胺弹头中，避免了反应性代谢物的形成。

共价抑制剂的下一个十年

迄今为止，共价抑制剂研究范围很窄，已批准的共价抑制剂药物一直集中在激酶家族和一个单一的半胱氨酸簇上。一个创新领域是探索半胱氨酸以外的弹头。赖氨酸似乎最有可能成为共价抑制剂靶向的下一个氨基酸。赖氨酸是蛋白质结合位点中比半胱氨酸更普遍的氨基酸，并且与半胱氨酸不同，它不仅限于细胞内靶标。半胱氨酸以还原的游离硫醇形式存在于细胞内，可被共价抑制剂靶向，而它通常参与细胞外蛋白质中的二硫键。然而，赖氨酸的亲核性低于半胱氨酸，因为它具有更高的pKa，取决于局部蛋白质环境，赖氨酸对共价药物的靶向作用将更具挑战性。Voxelotor是一种可逆的血红蛋白共价聚合抑制剂，于2019年获批，用醛弹头靶向氨基末端。

图8.罕见半胱氨酸(<10%的家庭成员)在人类核激素受体(NHR)、脂蛋白激酶和磷酸酶结构域的小分子结合部位的盛行。

图8显示，在其他蛋白质家族中存在多种半胱氨酸选择性共价靶向作用的机会，例如核激素受体(NHR)、脂蛋白激酶和磷酸酶。对药物结合位点的分析表明，这一发现广泛适用于可药物基因组。

PROTACs是一个活跃的研究领域。最近，人们一直在努力开发可以直接与目标蛋白或E3连接酶结合的共价降解剂，这使得有助于三元络合物的形成。

结论与展望

八种已获批准的共价抑制剂药物的成功鼓舞了共价药物的进一步发现。最近，第9种共价抑制剂药物 mobocertinib被批准用于治疗EGFR外显子20插入型NSCLC肺癌。共价抑制剂在自身免疫性疾病中的临床进展可能使这些药物的探索更加广泛，如果安全数据令人鼓舞，鉴于共价抑制剂的固有优势，可能会导致药物发现计划优先考虑共价药物发现而不是可逆药物。100多年来，共价药物为药典贡献了一些最有价值的药物。相信随着众多开发与评价共价抑制剂的策略的提出与改进，共价抑制剂必将迎来蓬勃发展并为人类疾病的治疗带来新的希望。

参考文献：

[1] Journal of Medicinal Chemistry 2022 65 (8),5886-5901 DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c02134

[2] 王傲雪, 裴俊平, 王贯等. 靶向特定氨基酸的共价抑制剂研究进展[J]. 药学进展, 2022, 第46卷(1):33-46.

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