戴卫国博士点评 | CAR-T最新进展:如何克服免疫逃逸与脱靶效应的难题

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戴卫国博士点评 | CAR-T最新进展:如何克服免疫逃逸与脱靶效应的难题




如何从CAR-T产品结构设计角度,梳理一些提高CAR-T细胞治疗的创新方法?有哪些防止脱靶效应、降低CAR-T治疗潜在毒性的新策略?


本期与您分享由药咖荟原创征稿内容——《CAR-T最新进展:如何克服免疫逃逸与脱靶效应的难题》,特邀戴卫国博士精心点评,一同“与智者同行·为创新赋能”!


戴卫国 博士


戴卫国博士点评 | CAR-T最新进展:如何克服免疫逃逸与脱靶效应的难题

门罗生物科技有限公司联合创始人、董事长

《药学进展》副主编

美国约翰霍普金斯大学博士


博士毕业后拥有二十多年美国工业界(美国强生、安进)新药产品研发及产品上市开发经验,在药物创新成果转化及产业化积累了丰富的实战经验。专业主要成就集中在生物大分子药物及CAR-T细胞治疗。领导或参与20多个创新药研发包括多个上市单抗产品,并在专业期刊发表研究学术论文50 多篇。2013年当选为美国药学家学会会士 (AAPS Fellow),美国药学家学会工业药学与生物药剂学部 (PPB Section)主席 (2014-2015)。现任美国药学家学会Fellow评审委员会主席。荣获多项声誉奖项。




专家点评


CAR-T细胞疗法是肿瘤治疗领域具有颠覆性、革命性意义的疗法。就在最近,又一款靶向CD19的CAR-T产品,药明巨诺开发的瑞基奥仑赛注射液(relma-cel,商品名:倍诺达)已获中国药监局批准文号,适应证为用于治疗经过二线或以上系统性治疗后成人患者的复发或难治性大B细胞淋巴瘤(r/r LBCL)。这是国内第2款、全球第6款获批的CAR-T产品。我们欣喜地看到,越来越多的CAR-T产品相继获批,开启了肿瘤治疗的新时代,使更多患者从中受益。


尽管CAR-T领域取得了非常大的进展,但是CAR-T产品成功主要集中在几种血液肿瘤适应证,并且随着时间的延长,有病情复发报道。此外CAR-T治疗实体瘤尚在继续努力中。CAR-T在实体瘤中的疗效不佳主要有以下几点原因:

 

1)缺少安全性好、特异性强的靶点。大部分实体瘤的抗原在其他正常器官与组织中也有少量表达,这就伴随了治疗的脱靶效应,导致严重的副反应;

2)实体肿瘤异质性,抗原特性及表达水平在不同肿瘤之间及同类型肿瘤的不同阶段之间均有较大的差异;

3)实体瘤通常在器官上形成坚实的团状物,CAR-T免疫细胞很难进入发挥作用;

4)高度免疫抑制的肿瘤微环境导致CAR-T 细胞难以生成并失去活性。

 

本文从CAR-T产品结构设计角度,梳理了一些提高CAR-T细胞治疗的创新方法。例如从通过设计双靶点CAR-T结构以防止抗原逃逸造成的复发,以加强治疗有效的长期性。此外本文侧重总结了几种防止脱靶效应、降低CAR-T治疗潜在毒性的新策略。这些CAR-T结构设计巧妙、新颖性强,对开发新一代CAR-T产品的设计与革新提供了非常好思路与启发,值得进一步探索。我们期待未来有更多的新方法使CAR-T疗法趋于完善,尤其在实体瘤取得实质性的成功。

 

需要提到的是,文中提到的这些新策略大多数还处于实验室研究阶段,其在临床能否达到令人满意的效果还需更多验证。另外,随着CAR-T设计方法复杂性的提高,其技术转化是关键。从产品开发角度,我们尤其需要考虑其对工艺生产、质量控制、成品成本带来的巨大挑战。一个CAR-T产品的成功开发需要研究、工艺开发、质量及生产、临床等多学科的通力合作。


文 | 杜瑾鸿


CAR-T细胞疗法最新进展:

如何克服免疫逃逸与脱靶效应的难题


CAR-T细胞疗法是一种精准的肿瘤靶向疗法,经过整整4代的改良,其疗效已得到极大提高,应用范围也不断拓宽,甚至已经有研究开始尝试将该疗法运用于艾滋病[1]。但直到当前,CAR-T细胞疗法仍然存在一些潜在的严重副作用或不足,限制了CAR-T进一步的应用化,例如CRS、ICANS、靶向脱肿瘤(on-target off-tumor)效应和抗原丢失等[2]。


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▲不同T细胞疗法的靶向脱肿瘤效应

(改编自Nat Rev Drug Discov. 2021 Jul;20(7):531-550.)


靶向脱肿瘤效应就是指,也有一些正常细胞表达在癌细胞表达的抗原,而针对这些抗原的CAR-T细胞可能出现“误杀”,导致副作用。而抗原丢失效应则是免疫逃逸的一种形式,会导致疗法失效。


近来,出现了一系列改进措施试图克服这些使CAR-T细胞丢失精准性的效应,且显示出良好效果。本文现在对这些方法做一梳理。


1

 双(多)特异性CAR-T细胞


1.1. 能同时靶向两种抗原的CAR分子

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▲Fig 1. 本文例举的三种TanCAR分子


最常见的例子即串行(tandem) CAR-T细胞,即tanCAR-T,即将靶向两种抗原的识别域(可能通过linker,比如G4S)连接起来。这种做法已出现大量的案例:


Hegde et al., 2016[3]:同时靶向HER2和IL13Rα2的CAR(CAR的胞外域依次是:前导序列(leader)、IL13(受体识别域)、GS重复序列linker、HER2特异性FRP5-scFv和hinge)以阻击胶质母细胞瘤。在实验中,这种tanCAR-T细胞表现出更强的持久性,减轻了抗原逃逸,增强的抗肿瘤效能,并提高了动物存活率;


Yang et al.,  2020[4]:将分别靶向CD70和B7-H3的scFv直接连接在一起(中间无linker)作为CAR,体内和体外实验均表明这种CAR-T细胞显示出更好的抗肿瘤效能。CD70和BY-H3的组合在肾、肝、乳腺、食管、结肠的癌症和黑素瘤中经常见到,因此这种CAR-T细胞具有广泛拓展的空间。


Zah et al., 2016[5]:同时靶向CD19和CD20的CAR-T细胞,以治疗急性髓性白血病(AML)。在本文中尝试了多种双特异性CAR的可能,例如调换anti-CD19-scFv和anti-CD20-scFv的顺序,在hinge与CD28跨膜区之间添加间隔肽段(spacer)等。


一般而言,双特异性CAR-T细胞主要是提供的是“或”门,即被双特异性CAR分子靶向的任意一种抗原出现在肿瘤细胞表面时,都会导致T细胞激活和细胞毒性。有些双特异性CAR分子在仅遇到单抗原时,比针对该抗原的单特异性CAR分子表现出来的T细胞毒性要弱些,可以减弱而无法消除其靶向脱肿瘤效应,而遇到双抗原时的细胞毒性又比后者强些,可以看作是“混合的”或门和与门。


多种双特异性CAR-T细胞早已开始进入临床试验。例如今年7月底,一种针对急性B淋巴细胞白血病和大B细胞淋巴瘤而设计的CD19-CD22 双特异性 CAR-T已经通过I期临床试验;上文提到的CD19-CD20双特异性CAR-T细胞也曾在剂量递增I期临床试验中表现良好。


1.2. 利用能靶向不同抗原的CAR/TCR作为共刺激信号

这种方法通常会依赖一些相对复杂的胞内通路,但同时也意味着策略可变性和可选择性。例如下面这两个例子:


Fisher et al., 2017[6]:构建了含有一个由anti-GD2-scFv和一个有DAP10的胞内域组成的CAR的Vγ9Vδ2+ T细胞,DAP10与另外一个靶向磷酸化抗原的TCR共同构成共刺激信号来激活T细胞。这个TCR原本需要与NKG2D构成共刺激信号,而DAP10是NKG2D的接头蛋白。但是神经母细胞瘤可能分泌可溶性配体下调或阻断NKG2D的功能,引起免疫逃逸。这里构造的CAR就起到了DAP10共刺激信号替代物的作用,既提高了精准性,又阻止了免疫逃逸。


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▲Fig 2. 工程化Vγ9Vδ2+ T细胞示意图


He et al.,  2020[7]:BissCAR——由能识别CD13的纳米抗体Nb157、CD3z、P2A(linker)、anti-TIM3-scFv、CD28、4-1BB组成,由于P2A会发生自剪切,BissCAR最终会分裂成两个CAR呈现在T细胞表面。Nb157是由作者开发的“肿瘤选择性抗体和抗原提取”(Sequentially Tumor-Selected Antibody and Antigen Retrieval, STAR)技术筛选出来的。为了成功靶向已对化疗出现抗性的急性髓性白血病干细胞,而不“误杀”正常的骨髓造血干细胞而选择了TIM3(在骨髓造血干细胞低表达或不表达)作为另一种共刺激信号的靶向抗原。实验表明BissCAR-T细胞未攻击K562-TIM3(CD13−TIM3+)系细胞,对NB4(CD13+TIM3−)系细胞仅表现出很低的激活和细胞因子释放,而对NB4-TIM3(CD13+TIM3+)系细胞表现出最大的细胞毒性。


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▲Fig 3.  BissCAR示意图


2

mCAR-T细胞[8]


mCAR-T细胞的CAR受体额外多出了一个掩蔽肽和蛋白酶敏感接头。掩蔽肽会遮住抗原识别域,经蛋白酶水解后切去掩蔽肽,才可将其暴露。该方法利用了肿瘤微环境中富含蛋白酶的特点,提高了靶向精度。且其抗肿瘤效果与一般CAR-T细胞相比基本相当。


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▲Fig 4. mCAR-T细胞示意图


3

NASCAR-T细胞[9]


NASCAR全称“肿瘤靶向性等位基因敏感CAR”(neoplasm-targeting allele-sensing CAR),是针对一种较常发生在肿瘤/癌转化过程中的被称为“克隆性杂合缺失”(clonal loss of heterogeneity, LOH)的变异所设计的。在90%的人类癌症中观察到此类事件,且通常涉及抑癌基因,可以利用LOH很好地将正常细胞与癌细胞区分开来。过去也有针对这一区分性进行药物设计的案例,如反义寡核苷酸、siRNA等,但效果大都不理想。针对LOH的发生进行编程则能够提高CAR-T细胞的精确性,这就是将CAR和异质性CAR(iCAR)同时引入CAR-T细胞,其中iCAR携带类似PD-1或CTLA-4的胞内域。在通过CRISPR技术人为制造的含有LOH的癌细胞系中,NASCAR-T细胞显示出良好抗肿瘤效能。


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▲Fig 5. NASCAR-T细胞示意图


4

synNotch受体平台


synNotch技术最初由Wendell Lim等人开发。Lim创建了名为Cell Design Labs的公司以转化该技术,后该公司于2017年末由吉利德科学旗下的Kite Pharma收购,平台也随之被纳入该公司的CAR-T开发平台。synNotch受体平台改进CAR-T细胞疗法的潜力在动物实验和一些临床研究中,针对多种肿瘤/癌症(如黑素瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤等)得到验证,现已即将走入临床试验阶段。


synNotch受体平台可以实现CAR-T细胞的编程。synNotch受体由生物体内原有的Notch受体改造而来。Notch受体识别并结合配体后,受到配体的拉拽,暴露出蛋白酶切位点,经TACE或ADAM金属蛋白酶酶切,胞外结构域脱落,并释放胞内部分。胞内部分有核定位序列、转录调控结构域(TRD)等。基于这一原理,将Notch受体的胞外部分替换成scFv或纳米抗体等,胞内部分替换成其他的TRD(如Gal4-VP64、LexA-VP64、Gal4-KRAB等),生成的synNotch受体就实现了编程。由此可以构建各种逻辑门,包括[10]:


与门(AND-gate)——又分“串联与门”和“并联与门”。串联与门是形如「anti-A1 synNotch 激活anti-A2 synNotch的表达,anti-A2 synNotch激活anti-A3 synNotch的表达,……,最后激活anti-An CAR的表达」的模式,优点是可以无限制地添加识别抗原的数量,缺点是反应时间会因抗原数量而延长;并联与门则是将最后的CAR进行可组装的分拆,每个部分可由其中的一个synNotch受体激活,解决了反应时间延长的问题,但随着所靶向抗原的增加,CAR将难以分拆。


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▲Fig 6. “串联与门”(AND-gate in series)


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▲Fig 7. “并联与门”(AND-gate in tandem)


非门(OFF-gate)——iCAR,或者将synNotch编程为激活凋亡蛋白(如tBID)即可。


或门(OR-gate)则可将CAR/TCR和synNotch混用。由这三种门还可以编设更复杂的门,从能够实现更精准的靶向。


显而易见,synNotch的应用可以不仅限于CAR-T细胞疗法,Lim还进行了多种拓展性的尝试,比如可以将T细胞编程并到达指定位置后进行药物递送[11];又比如构建inNotch受体,基于pMHC,还可将胞内的抗原纳入synNotch的识别范围[10];此外还基于synNotch实现了对特定膜抗原不同浓度范围敏感的CAR-T细胞,可被用来靶向过表达某些抗原(如HER2)的肿瘤细胞等[12]。



结语


以往的CAR-T细胞只有单特异性,导致很难为CAR-T细胞寻找合适的肿瘤表面抗原,在很多情况下,不一定总能找到一种只在肿瘤表面表达而不在正常细胞表达的抗原。所以,许多研究人员从提高CAR-T细胞的靶向能力方面入手开展了工作,上面只是介绍了几种具有代表性的策略,而这还只是聚焦于改造CAR-T细胞的靶向性方面,在改造CAR-T细胞的其他性能,比如其活性/细胞毒性的可控性(可以人为调控,比如为T细胞添加药物接口,通过药物调节CAR-T细胞的活性)等方面,研究者还做了更多尝试。以后,这种改进版本还会越来越多,并更多地考虑到患者的实际情况,实际上也是精准医学的思想在这一领域的反映。



参考文献:

1. Maldini et al., Dual CD4-based CAR T cells with distinct costimulatory domains mitigate HIV pathogenesis in vivo. Nat Med. 2020 Nov;26(11):1776-1787.

2. Schubert et al., Side-effect management of chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy. Ann Oncol. 2021 Jan;32(1):34-48.

3. Hegde et al., Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Rα2 mitigate tumor antigen escape. J Clin Invest. 2016 Aug 1;126(8):3036-52.

4. Yang et al., Tandem CAR-T cells targeting CD70 and B7-H3 exhibit potent preclinical activity against multiple solid tumors. Theranostics. 2020 Jun 18;10(17):7622-7634.

5. Zah et al., T Cells Expressing CD19/CD20 Bispecific Chimeric Antigen Receptors Prevent Antigen Escape by Malignant B Cells. Cancer Immunol Res. 2016 Jun;4(6):498-508.

6. Fisher et al., Avoidance of On-Target Off-Tumor Activation Using a Co-stimulation-Only Chimeric Antigen Receptor. Mol Ther. 2017 May 3;25(5):1234-1247.

7. He et al., Bispecific and split CAR T cells targeting CD13 and TIM3 eradicate acute myeloid leukemia. Blood. 2020 Mar 5;135(10):713-723.

8. Han et al., Masked Chimeric Antigen Receptor for Tumor-Specific Activation. Mol Ther. 2017 Jan 4;25(1):274-284.

9. Hwang et al., Targeting loss of heterozygosity for cancer-specific immunotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Mar 23;118(12):e2022410118.

10. Williams et al., Precise T cell recognition programs designed by transcriptionally linking multiple receptors. Science. 2020 Nov 27;370(6520):1099-1104.

11. Roybal et al., Engineering T Cells with Customized Therapeutic Response Programs Using Synthetic Notch Receptors. Cell. 2016 Oct 6;167(2):419-432.e16.

12. Hernandez-Lopez et al., T cell circuits that sense antigen density with an ultrasensitive threshold. Science. 2021 Mar 12;371(6534):1166-1171.


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