【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

基因疗法和寡核苷酸药物能够缓解或治愈许多传统手段无法应对的疾病,特别是由基因缺陷或异常引起的疾病。在这两种新兴疗法中,基因转运的目的是通过将编码功能蛋白的基因引入细胞以使细胞和器官正常化,而20个左右碱基的短链核苷酸则被用于调节细胞内RNA的表达和功能。由于裸露的核酸易被组织或细胞内的酶降解、或是细胞摄取效果较差等原因,科学家们致力于开发递送载体以转运核酸。而理想的递送和转染系统应具有高转染效率、对细胞低毒性和细胞特异性等优点。

病毒载体由于能够有效感染宿主细胞,已成为基因转运最热门的载体。目前,常用的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒(属于逆转录病毒)、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒等。每种病毒都有自身的优势和不足,例如,逆转录病毒和慢病毒载体可以整合到宿主基因组中,甚至在单次给药后也能长期表达基因,但其细胞感染不具靶向性且可能出现基因插入突变等;腺病毒载体可以有效转导分裂和非分裂细胞类型,但可能引起免疫刺激;腺相关病毒也可以感染许多非分裂和分裂细胞类型,但DNA插入能力有限。虽然经过了多年的发展和改进,但病毒载体依然有较高的细胞毒性和免疫原性,容易引起炎症反应,且存在费用高、装载DNA大小和数量有限等问题。

为弥补病毒载体的不足,非病毒递送系统因低毒性、靶向递送的潜力、长期稳定性、DNA装载量较高、化学结构可控、免疫原性较小、易于大量制备且生产成本相对较低而受到越来越多的关注。
无吞噬功能的真核细胞只能内化直径小于1微米的颗粒,非纳米基因载体的体积较大,与外源基因结合后形成的复合体进一步增大,因而转染效率较低。纳米颗粒是粒径在10-1000nm范围内的颗粒状分散体或固体颗粒。使用纳米颗粒进行递送可获得增强的渗透性和滞留(EPR)效果。其较高的电势和比表面积使得基因载量较大,还可保护核酸分子免于酶促降解和免疫识别,与其他载体相比,具有更高的跨细胞膜运输效率。另外,纳米载体通常具有良好的生物相容性,甚至生物可降解性,因而对细胞的生长和代谢影响较小。目前广泛使用的纳米颗粒可分为有机纳米颗粒和无机纳米颗粒,下面将对这两种材料分别进行阐述。
 

表1. 不同纳米颗粒载体特点

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择表2. 部分使用纳米颗粒载体的寡核苷酸药物

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

有机纳米颗粒

可以通过化学键合或物理包埋的方式将药物结合到有机纳米颗粒中。有机纳米颗粒包括阳离子聚合物纳米颗粒和基于脂质的体系等,典型的有机纳米颗粒包括脂质体、纳米乳剂、树枝状聚合物和聚合物纳米颗粒。 

图1. 有机纳米颗粒及其他药物载体【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

01

脂质纳米颗粒LNP

目前基于脂质的体系主要包括脂质体、胶束、乳剂和固体脂质纳米颗粒(SLN)。脂质体由磷脂组成,磷脂易于在水性溶剂中形成封闭的脂质双分子层,从而形成纳米级别的颗粒。脂质体纳米载体已被广泛用于寡核苷酸药物的研究中,特别是反义寡核苷酸ASO)和siRNA。脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体通常被用作递送载体,因为它们易于与带负电荷的核酸结合,即通过静电力与核酸中存在的带负电的磷酸基团相互作用,形成纳米颗粒。这种脂质复合物能够保护其中的遗传物质免遭降解,并在哺乳动物细胞内递送。例如,FDA批准用于治疗遗传性淀粉样变性的siRNA药物Onpattro,就是将siRNA包裹在脂质纳米颗粒中,通过静脉输注将药物直接递送至肝脏,防止人体产生致病蛋白。

图2. 脂质纳米颗粒【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

02

聚合物纳米颗粒(PNP

阳离子聚合物因其易于合成和灵活的特性而成为非病毒基因递送载体的另一个主要类型。例如,合成或天然siRNA纳米聚合物是胶体固体材料,专门设计用于在体内降解而不会产生有毒成分。聚合物可以与核酸结合,在生理pH下形成多聚复合物,以促进基因递送。通常情况下,聚合物纳米颗粒具有带正电的单元,以促进与核酸的静电结合。但是,通过使用可降解的连接物(如二硫键或巯基-马来酰亚胺键),也可实现核酸与聚合物的共价连接。
图3. 聚合物纳米颗粒
【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择
该类别中具有代表性的是合成聚合物,如多聚-L-赖氨酸、多聚-L-鸟氨酸、直链和支链聚乙烯亚胺(PEI)、二乙氨基乙基-右旋糖酐、聚酰胺⁃胺树形高分子(PAMAM)和聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)。另外,天然聚合物,如壳聚糖(CS)、葡聚糖和明胶以及复杂的合成物质等目前也在研究中。
表3. 代表性聚合物纳米颗粒载体特点

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

无机纳米颗粒

无机纳米颗粒(INPs)由无机颗粒和可生物降解的聚阳离子合成。典型的无机纳米颗粒包括金属、金属氧化物和碳材料(如富勒烯、纳米管、纤维)和由超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)组成的磁性纳米颗粒。较常用的是介孔二氧化硅纳米粒子(MSN),具有孔道均匀、易于官能化、生物相容性、高比表面积、大孔容和可生物降解性等特性。为提高MSN的基因装载效率和细胞吸收效率,其表面或内孔会用阳离子聚合物包被。另外,量子点是新型的胶体半导体纳米晶体,具有优异的光学和电子特性。纳米金刚石则是正在研究的用于siRNA治疗药物递送的最新递送系统。

图4. 无机纳米材料

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

01

金属纳米颗粒

作为基因载体,金属纳米颗粒的结构通常以金属为核,功能材料为壳,包括良好的生物相容性、储存稳定性、易于制备、多功能性、毒副作用小等特点,它还能使某些具有基因递送性能的材料获得靶向性、可控性及可成像性等功能。但金属纳米颗粒在体内不易降解,安全隐患使得其临床应用受到一定限制。由于磁性纳米颗粒和金纳米颗粒具有生物相容性和较低的毒性,因此被科研人员作为递送载体而广泛研究。 
表4. 代表性金属纳米颗粒载体特点
【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

02

无机非金属纳米材料

一些基因载体是由无机非金属纳米材料与功能性的分子杂合得到,包括碳材料和硅材料。无机非金属纳米颗粒的生物安全性优于金属纳米颗粒,修饰在其上的功能分子通常在转染效率上优于功能分子本身,但无机非金属纳米颗粒的生物降解性能仍有待改善。

表5. 代表性无机非金属纳米材料载体特点

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

03

其他

脂质-聚合物杂化纳米粒(LPHNP)是包含两个或多个纳米结构的纳米颗粒,可能同时使用有机和无机材料来实现功能,这些材料有助于减少不良副作用。稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)是在不同动物模型中都展现出前景的siRNA分子递送平台,它由基于融合脂质和阳离子脂质混合物的脂质双分子层组成,该脂质双分子层能够实现内体释放并因此促进siRNA的细胞摄取。此外,在配制过程中,SNALP表面还涂有PEG化脂质体,提供中性的亲水外层,以使这些颗粒在注射时可在血流中保持稳定。

图5. 核酸衍生纳米颗粒

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

总结

鉴于其高特异性、易修饰性和有效靶点,基因疗法和寡核苷酸药物一直备受关注。然而,由于核酸在血液中不稳定,相关给药递送系统的设计始终面临诸多挑战,新型疗法的潜力还有待进一步挖掘。作为实现核酸药物有效递送的最佳方法之一,纳米颗粒载体已受到业界认可。当然,不可否认的是,纳米颗粒载体的转染效率低和毒性等缺点仍需改善。

参考来源

1、Katyayani Tatiparti et al.,(2017) siRNA Delivery Strategies: A Comprehensive Review of Recent Developments. doi:10.3390/nano7040077 

2、Yong Xin et al.,(2017) Nano-based delivery of RNAi in cancer therapy. doi:10.1186/s12943-017-0683-y

3、古晓晓 等,(2015) 基于纳米材料的基因载体. doi:10.7536/PC150163

4、华金证券——基因治疗:医学革命正在到来(上篇·技术)

5、广证恒生——【小核酸药物 专题报告】 “沉默”是金,RNAi药物黎明破晓正当时

 

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基因疗法和寡核苷酸药物能够缓解或治愈许多传统手段无法应对的疾病,特别是由基因缺陷或异常引起的疾病。在这两种新兴疗法中,基因转运的目的是通过将编码功能蛋白的基因引入细胞以使细胞和器官正常化,而20个左右碱基的短链核苷酸则被用于调节细胞内RNA的表达和功能。由于裸露的核酸易被组织或细胞内的酶降解、或是细胞摄取效果较差等原因,科学家们致力于开发递送载体以转运核酸。而理想的递送和转染系统应具有高转染效率、对细胞低毒性和细胞特异性等优点。

病毒载体由于能够有效感染宿主细胞,已成为基因转运最热门的载体。目前,常用的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒(属于逆转录病毒)、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒等。每种病毒都有自身的优势和不足,例如,逆转录病毒和慢病毒载体可以整合到宿主基因组中,甚至在单次给药后也能长期表达基因,但其细胞感染不具靶向性且可能出现基因插入突变等;腺病毒载体可以有效转导分裂和非分裂细胞类型,但可能引起免疫刺激;腺相关病毒也可以感染许多非分裂和分裂细胞类型,但DNA插入能力有限。虽然经过了多年的发展和改进,但病毒载体依然有较高的细胞毒性和免疫原性,容易引起炎症反应,且存在费用高、装载DNA大小和数量有限等问题。

为弥补病毒载体的不足,非病毒递送系统因低毒性、靶向递送的潜力、长期稳定性、DNA装载量较高、化学结构可控、免疫原性较小、易于大量制备且生产成本相对较低而受到越来越多的关注。
无吞噬功能的真核细胞只能内化直径小于1微米的颗粒,非纳米基因载体的体积较大,与外源基因结合后形成的复合体进一步增大,因而转染效率较低。纳米颗粒是粒径在10-1000nm范围内的颗粒状分散体或固体颗粒。使用纳米颗粒进行递送可获得增强的渗透性和滞留(EPR)效果。其较高的电势和比表面积使得基因载量较大,还可保护核酸分子免于酶促降解和免疫识别,与其他载体相比,具有更高的跨细胞膜运输效率。另外,纳米载体通常具有良好的生物相容性,甚至生物可降解性,因而对细胞的生长和代谢影响较小。目前广泛使用的纳米颗粒可分为有机纳米颗粒和无机纳米颗粒,下面将对这两种材料分别进行阐述。
 

表1. 不同纳米颗粒载体特点

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择表2. 部分使用纳米颗粒载体的寡核苷酸药物

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有机纳米颗粒

可以通过化学键合或物理包埋的方式将药物结合到有机纳米颗粒中。有机纳米颗粒包括阳离子聚合物纳米颗粒和基于脂质的体系等,典型的有机纳米颗粒包括脂质体、纳米乳剂、树枝状聚合物和聚合物纳米颗粒。 

图1. 有机纳米颗粒及其他药物载体【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

01

脂质纳米颗粒LNP

目前基于脂质的体系主要包括脂质体、胶束、乳剂和固体脂质纳米颗粒(SLN)。脂质体由磷脂组成,磷脂易于在水性溶剂中形成封闭的脂质双分子层,从而形成纳米级别的颗粒。脂质体纳米载体已被广泛用于寡核苷酸药物的研究中,特别是反义寡核苷酸ASO)和siRNA。脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体通常被用作递送载体,因为它们易于与带负电荷的核酸结合,即通过静电力与核酸中存在的带负电的磷酸基团相互作用,形成纳米颗粒。这种脂质复合物能够保护其中的遗传物质免遭降解,并在哺乳动物细胞内递送。例如,FDA批准用于治疗遗传性淀粉样变性的siRNA药物Onpattro,就是将siRNA包裹在脂质纳米颗粒中,通过静脉输注将药物直接递送至肝脏,防止人体产生致病蛋白。

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02

聚合物纳米颗粒(PNP

阳离子聚合物因其易于合成和灵活的特性而成为非病毒基因递送载体的另一个主要类型。例如,合成或天然siRNA纳米聚合物是胶体固体材料,专门设计用于在体内降解而不会产生有毒成分。聚合物可以与核酸结合,在生理pH下形成多聚复合物,以促进基因递送。通常情况下,聚合物纳米颗粒具有带正电的单元,以促进与核酸的静电结合。但是,通过使用可降解的连接物(如二硫键或巯基-马来酰亚胺键),也可实现核酸与聚合物的共价连接。
图3. 聚合物纳米颗粒
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该类别中具有代表性的是合成聚合物,如多聚-L-赖氨酸、多聚-L-鸟氨酸、直链和支链聚乙烯亚胺(PEI)、二乙氨基乙基-右旋糖酐、聚酰胺⁃胺树形高分子(PAMAM)和聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)。另外,天然聚合物,如壳聚糖(CS)、葡聚糖和明胶以及复杂的合成物质等目前也在研究中。
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无机纳米颗粒

无机纳米颗粒(INPs)由无机颗粒和可生物降解的聚阳离子合成。典型的无机纳米颗粒包括金属、金属氧化物和碳材料(如富勒烯、纳米管、纤维)和由超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)组成的磁性纳米颗粒。较常用的是介孔二氧化硅纳米粒子(MSN),具有孔道均匀、易于官能化、生物相容性、高比表面积、大孔容和可生物降解性等特性。为提高MSN的基因装载效率和细胞吸收效率,其表面或内孔会用阳离子聚合物包被。另外,量子点是新型的胶体半导体纳米晶体,具有优异的光学和电子特性。纳米金刚石则是正在研究的用于siRNA治疗药物递送的最新递送系统。

图4. 无机纳米材料

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01

金属纳米颗粒

作为基因载体,金属纳米颗粒的结构通常以金属为核,功能材料为壳,包括良好的生物相容性、储存稳定性、易于制备、多功能性、毒副作用小等特点,它还能使某些具有基因递送性能的材料获得靶向性、可控性及可成像性等功能。但金属纳米颗粒在体内不易降解,安全隐患使得其临床应用受到一定限制。由于磁性纳米颗粒和金纳米颗粒具有生物相容性和较低的毒性,因此被科研人员作为递送载体而广泛研究。 
表4. 代表性金属纳米颗粒载体特点
【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

02

无机非金属纳米材料

一些基因载体是由无机非金属纳米材料与功能性的分子杂合得到,包括碳材料和硅材料。无机非金属纳米颗粒的生物安全性优于金属纳米颗粒,修饰在其上的功能分子通常在转染效率上优于功能分子本身,但无机非金属纳米颗粒的生物降解性能仍有待改善。

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03

其他

脂质-聚合物杂化纳米粒(LPHNP)是包含两个或多个纳米结构的纳米颗粒,可能同时使用有机和无机材料来实现功能,这些材料有助于减少不良副作用。稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)是在不同动物模型中都展现出前景的siRNA分子递送平台,它由基于融合脂质和阳离子脂质混合物的脂质双分子层组成,该脂质双分子层能够实现内体释放并因此促进siRNA的细胞摄取。此外,在配制过程中,SNALP表面还涂有PEG化脂质体,提供中性的亲水外层,以使这些颗粒在注射时可在血流中保持稳定。

图5. 核酸衍生纳米颗粒

【行研】纳米颗粒载体——核酸递送的另一种选择

总结

鉴于其高特异性、易修饰性和有效靶点,基因疗法和寡核苷酸药物一直备受关注。然而,由于核酸在血液中不稳定,相关给药递送系统的设计始终面临诸多挑战,新型疗法的潜力还有待进一步挖掘。作为实现核酸药物有效递送的最佳方法之一,纳米颗粒载体已受到业界认可。当然,不可否认的是,纳米颗粒载体的转染效率低和毒性等缺点仍需改善。

参考来源

1、Katyayani Tatiparti et al.,(2017) siRNA Delivery Strategies: A Comprehensive Review of Recent Developments. doi:10.3390/nano7040077 

2、Yong Xin et al.,(2017) Nano-based delivery of RNAi in cancer therapy. doi:10.1186/s12943-017-0683-y

3、古晓晓 等,(2015) 基于纳米材料的基因载体. doi:10.7536/PC150163

4、华金证券——基因治疗:医学革命正在到来(上篇·技术)

5、广证恒生——【小核酸药物 专题报告】 “沉默”是金,RNAi药物黎明破晓正当时

 

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