隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

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隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

正文共:8211字11图

预计阅读时间:21分钟

 

(作者:刘珠果 优选资本 来源:biotechventurecapital)

药物靶标具有更深层次的含义,它是指在正常或异常细胞中具有重要功能,可以与药物相互作用并产生临床疗效的分子,包括基因、受体、优选资本、 酶、离子通道、转运体、核酸等。纵观药物发现的历史,可以发现药物筛选是药物发现的基础,随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来,高通量高内涵的筛选方法得以开发,以基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、表观遗传学以及基因编辑等方法为基础的多种药物筛选和鉴定模型得以建立,越来越多的药物靶标得以发现。

通常我们把无法通过传统药物研发手段干预的蛋白靶点定义为难以成药的靶标。这些蛋白靶标多数位于细胞内大分子药物很难作用到,这些靶标蛋白在疾病的发生发展中发挥了重要的作用,因而十分重要但又很难成药,往往需要经过长期研究,尝试多种手段和方法后才能修炼成功。

诗人陆游的一句名句“山穷水复疑无路,柳暗花明又一村。”是这类靶标药物开发的真实写照。

传统意义上难以成药的靶标在肿瘤中更常见,根据靶标的成药性我们可以将癌症药物靶点分为两大类,一类是已经成药的靶点:如丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶、生长因子受体、GPCRs等。另一类是认为用传统的方法较难解决的一类靶标,主要包括原癌基因转录因子以及磷酸酶类。

这些靶标蛋白通常具有重要的生理功能,其功能失常通常和肿瘤发生密切相关,由于这几类靶点都是细胞内蛋白靶标,一直以来人们试图针对这些靶点开发小分子药物,但由于多种原因一直进展缓慢,随着近几年来方法手段及研究的深入,在这些难以成药靶点的药物开发上也有了较大的突破,针对这些靶点开发的小分子药物陆续进入到临床研究阶段,了解这类药物的成功开发经验对于我们开发同类难以成药靶点的药物具有重要的借鉴意义,下面我们从蛋白磷酸酶、原癌基因及转录因子靶点药物成功开发的案例看看难以成药靶标的修炼过程。(见下图)

隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

(黄色标注的是细胞外或细胞内的已经成药的一些靶点。红色标注的3类靶点是的药物开发相对滞后,通常认为是难以成药的靶点。图中的Y表示抗体。)

蛋白酪氨酸磷酸酶

蛋白酪氨酸磷酸酶PTPs)是细胞内一种必需的信号传导酶,他与蛋白酪氨酸激酶一起调节细胞内的酪氨酸磷酸化水平,维持正常水平的酪氨酸磷酸化对于细胞增殖,代谢,运动和存活十分重要。

PTP表达量的变化,调节失常和突变导致的异常酪氨酸磷酸化与癌症,糖尿病及肥胖症,自身免疫性疾病和传染病等多种人类疾病密切相关。长期以来PTP一直作为一个极具吸引力的药物靶标而备受关注,然而成功开发PTP的药物需要解决诸多问题具有较大的难度。

隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

简单总结一下PTPs难以成药的原因主要有以下3个方面:

1)PTP家族成员活性位点(即pTyr结合口袋)高度保守,打个形象的比喻就是PTP家族成员活性位点长像十分相似,很难加以识别;

2)PTP家族成员的活性位点区域带正电荷,更易于同带负电荷的分子结合,然而我们知道带负电的分子是很难透过细胞膜进入细胞内;

3)在带正电荷的活性位点环境中催化Cys的侧链以硫醇盐阴离子(pKa~5)存在,使其成为各种亲电试剂的主要靶标,这些亲电试剂包括以下几类:1)碘乙酰胺,马来酰亚胺,α-卤代羰基。2)氧化剂,包括过氧化氢,醌和菲蒽二酮3)重金属,如Zn2 +和Cu2+这些硫醇盐反应性分子通常会使高通量筛选的假阳性增加,从而增加获取目标化合物的难度。

如何化解这些难题呢?经过长期的研究和探索,发现采用基于片段的筛选方法,针对PTP活性位点和活性位点周边的非保守序列进行筛选的策略,可以提高PTP抑制剂的效力,选择性和生物利用度。

我们知道pTyr在PTP底物识别中具有重要作用,通过鉴定可有效占据活性位点口袋并不可水解的pTyr模拟物,并充分考虑pTyr侧翼的氨基酸残基对于有效的PTP底物转换的重要性,针对pTyr近端残基相互作用的活性位点边界的结合口袋设计抑制剂。

抑制剂通过产生与PTP活性位点和不同外周口袋相互作用的二价配体,通过靶向除活性位点之外的保守性较低的位点,可以使抑制剂亲和力和选择性大大增加。通过此种方式筛选获得的不可水解的pTyr模拟物具有足够的极性以结合PTP活性位点,而且仍然能够有效地穿透细胞膜。

Zhong-Yin Zhang分析了几个基于不可水解的pTyr模拟片段的方法靶向PTP活性位点和相邻的低保守口袋的成功案例,并证明此种方法在肿瘤,糖尿病及肥胖症,自身免疫和结核病动物模型中获得具有高亲和力,选择性和强大体内功效的PTP抑制剂是完全可行的。(见下图)

隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

(基于pTyr模拟片段的方法,用于靶向PTP活性位点和相邻较少保守的口袋,以提高抑制剂效力和选择性)

丝氨酸苏氨酸磷酸酶

蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶通过调节靶蛋白的去磷酸化,调节细胞的生长、增殖和分化,其表达或活性异常均可以引起细胞生物学行为改变。对蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂的研究有助于我们了解细胞生长、发育、调控的机制,寻找预防和治疗肿瘤的新途径。

早期的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂主要作为天然产物分离。这些具有多个手性位点的化学复杂分子,其天然产物相对于底物是混杂的,这使得它们在癌症治疗方面的开发成为一个挑战。

最近,一些癌症相关的Ser/Thr磷酸酶的开发取得了显著进展,下边我们和大家分享一下丝氨酸/苏氨酸磷酸酶家族的重量级成员PP1抑制剂的开发过程。

PP1磷酸酶广泛表达于所有真核细胞中并在细胞减数分裂、凋亡、蛋白质合成及代谢,细胞骨架重组以及膜受体和通道的调节过程中发挥了及其重要的作用。多种PP1的不同形式是与PP1磷酸酶的众多功能相适应的。然而,每种组装的功能性PP1酶具有严格的底物特异性并能引发特定的生物学反应。每种功能性PP1酶由催化亚基和调节亚基组成。PP1的催化亚基在所有真核生物中高度保守,大约具有70%以上的序列同源性,高度的同源性保证了催化亚基具有相同的蛋白折叠结构和激活位点。然而PP1的调节亚基数量众多,目前已经鉴定出至少100种PP1调节亚基,推测的PP1调节亚基的数量会更多。对已知不同真核生物谱系中调节亚基的分析表明,伴随着多细胞生物的进化过程,PP1调节亚基数量呈现爆炸式增长。这些调节亚基可以将PP1催化亚基靶向特定的亚细胞器并调节底物特异性,因此,催化亚基和特定调节亚基之间的相互作用是PP1功能的核心。

目前已知的大部分蛋白质磷酸化发生在丝氨酸和苏氨酸残基上,PP1磷酸酶的催化亚基PP1c参与了大多数丝氨酸/苏氨酸的去磷酸化,PP1c是一种单结构域蛋白,在细胞中不是游离的,而是全磷酸酶复合物的一部分。单纯针对PP1c的催化抑制剂不具有选择性,因为它们会抑制数百种全磷酸酶从而产生较大的毒性。对于这一难以成药靶标药物的开发也经历了较长的时间。

最初通过表型筛选发现了化合物Guanabenz和Sephin1可以选择性地抑制PP1c的调节亚基R15A,并且不显著抑制R15B PP1。Krzyzosiak根据相关研究推断针对R15B:PP1复合物而不是R15A可能是获得目标表型有效抑制剂的更好选择。为了实现这一目标,Krzyzosiak及其同事在表面等离子共振传感器芯片上重建了部分R15A / PP1和R15B-PP1全酶,并使用69个Ganabenz衍生物的小型文库进行了复合结合筛选,最终发现了一个化合物Raphin1,其结合R15B-PP1的选择性比R15A-PP1复合物高30倍。

在细胞实验中Raphin1增加eIF2a磷酸化并减少了蛋白质合成,而且在敲除R15B亚基后这些作用丧失,证实Raphin1的作用机制确实是通过R15B介导的。在动物实验中当以低至2mg / kg的剂量给予小鼠时,Raphin1以足够高的浓度积聚在包括脑的组织中以抑制R15B并且没有观察到相关的副作用发生。在亨廷顿氏疾病病小鼠模型中,Raphin1每天给予小鼠一次连续给药6周后,观察到不溶性亨廷顿蛋白聚集体的显著减少并显著延缓了疾病的发作。对于PP1全酶抑制剂的开发还可以采用其他一些方法,这些方法包括阻止PP1调节亚基与其生理底物接触或阻止调节亚基和催化亚基的相互作用,此外在某些PP1全酶上可能还存在其他与功能相关的关键口袋可以被利用。在未来的相关工作中,应该纳入定量总和磷酸化蛋白质组学分析(未在Krzyzosiak等人的研究中使用),以更好地表征已鉴定的PP1全酶抑制剂的体内特异性。

转录因子

众所周知各种癌症中相关基因转录及表达的异常和转录因子之间存在直接或间接的关系。早期发现的一些癌基因本身就作为转录因子(c-MYCSTAT3)或作为转录增强的信号起作用。

长期以来人们对开发修饰这些转录改变的策略存在浓厚的兴趣,转录因子形成蛋白质复合物,与DNA序列上的特定位点结合而启动基因转录。然而用小分子阻止核转录因子蛋白和DNA或共调节蛋白之间的功能性相互作用非常困难,因为参与这些相互作用的转录因子上的位点通常是大的,平坦的表面区域,这恰恰是与大多数酶或受体上发现的深的可药用结合口袋相反。

目前利用小分子抑制剂改变致癌转录事件的最佳开发策略是防止蛋白质之间的相互作用而不是破坏转录因子和DNA相互结合。下边我们看几个实例:

MYC-MAX

c-MYC是属于螺旋螺旋亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子,与几种蛋白质(包括MAX)形成高效的二聚体,是正常细胞增殖,代谢,分化和凋亡的主要调节因子。

长期以来,c-MYC被认为是抗癌药物靶标的希格斯玻色子,因为它在许多人类癌症中高表达和功能失调。然而人们很快认识到c-MYC几乎普遍参与正常的生理过程,人们担心c-MYC抑制会导致不可接受的毒性。

因为MYC蛋白质蛋白质相互作用(例如,MYC-MAXMYC-TRRAP)发生在一个相对较大,平坦且结构模糊的界面上,因此开发相关抑制剂具有较大的难度。

令人鼓舞的是,最近的研究揭示了干扰c-MYC转录或c-MYC-MAX二聚化的其他小分子工具化合物(例如,IIA6B17NY2267JY-3-094Mycro3),有了这些基础进一步开发其抑制剂主要是提高它们的特异性和亲和力。调节c-MYC的几种挑衅性替代方法正在出现。Omomyc,一种MYC显性负肽,从其二聚化配偶体(例如MAXMIZ-1)中螯合c-MYC,选择性地阻止MYC依赖性转录激活。

Omomyc在肺癌和胶质瘤的临床前小鼠模型中显示出有效的抗肿瘤活性。间接靶向MYC作为抗癌治疗策略来自BET溴结构域小分子抑制剂的研究,其通过干扰MYC调节辅助因子的乙酰基赖氨酸识别结构域有效抑制MYC基因表达。目前多个BET溴结构域抑制剂已经进入到临床一期阶段。

有趣的是,MAX同源二聚体的小分子稳定剂也通过干扰MYC-MAX的异二聚化作为MYC信号传导的潜在抑制剂。另外一种替代策略是采用c-MYC siRNADCR-MYC)的脂质纳米颗粒制剂抑制c-MYC翻译和随后的蛋白质表达,这可以导致肿瘤细胞生长的减少。

P53

P53是大家十分熟悉的一个难以成药靶点,TP53是人类癌症中最常见的突变基因,它编码肿瘤抑制转录因子p53,它是DNA修复,代谢,细胞周期停滞,细胞凋亡和衰老过程的关键调节因子。研究证实p53的缺失或突变会加剧宿主细胞基因组的不稳定性,增加患癌风险,并且增加肿瘤发生后癌细胞的侵袭迁移和耐药能力,因此,它一直是最受追捧的分子癌靶点之一。p53虽是研究最为深入的癌症相关基因,但相关药物的开发却较慢,这与p53突变的复杂性有很大关系。

针对不同的突变型p53主要有以下2种策略:直接作用于突变型的p53,包括恢复野生型p53的活性及诱导突变型p53的降解;另外一种策略则是间接作用于突变型的p53蛋白,可以通过靶向p53突变的癌变细胞信号通路或靶向G2/M期检查点。

目前利用直接作用于突变型的p53策略开发的抑制剂有多个进入临床早期研究阶段,其中比较火的是针对p53-MDM2相互作用开发相关的抑制剂,MDM2体内最重要的作用是抑制野生型p53的激活转录功能和抗肿瘤活性,基因敲除实验发现MDM2基因完全缺失的小鼠不能存活,而p53MDM2都缺失的小鼠则能存活,故而这种抑制作用在胚胎发育的最早期就存在,所以有人将MDM2称作p53大哥,很多证据表明MDM2是癌基因,因此设计小分子抑制剂干扰p53-MDM2的相互作用能够达到多重效果。

癌基因

癌基因的种类很多,下边我们看一个明星分子原癌基因RASRas蛋白是一类大小为21kD左右的单体三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白,为原癌基因RAS的表达产物,其存在于人类的大部分细胞中,能够结合GTP并且具有较弱的GTP水解酶活性。

人类三种RAS原癌基因能够编码出四类Ras相关蛋白:N-RasH-RasK-Ras4AK-Ras4B其中K-Ras4B蛋白在肿瘤病人体内是突变率最高的一类亚型蛋白。RAS被认为是人类第一个发现的突变致癌基因,RAS是一种非常珍贵的抗癌药物靶点不可否认,大量研究证据表明,多达30%的肿瘤样本中存在RAS基因突变,在四种最致命的人类恶性肿瘤中的三种:结肠癌、肺癌和胰腺癌中都存在RAS基因突变。

虽然经过30年的深入研究,开发临床可行的RAS抑制剂一直进展缓慢,这给大家形成一个普遍的印象即RAS癌蛋白是不可成药的,与许多其他难以成药靶点一样,RAS蛋白表面缺乏深的、适合药物作用的疏水囊,这大大阻碍了高亲和力抑制剂的开发,目前发现了一些低亲和力抑制剂,但这些抑制剂都缺乏效力或存在一些不良影响。

ras蛋白的激活同时受到时间和空间调控,早期人们希望间接控制其空间调控来阻断ras蛋白的活性,最初是开发了针对翻译后修饰HRAS的法尼基化转移酶抑制剂,但是临床试验结果令人失望,因此可能同时阻断法尼基转移酶和香叶转移酶1才可能有一定作用,但由于这些酶有数百种其他底物,这就产生了对可能的靶外效应的担忧。

直到最近RAS抑制剂的临床开发终于有所突破,Mirati Therapeutics(MRTX)公司成功开发了针对K-RASG12C突变的小分子抑制剂MRTX849,该抑制剂主要同12号密码子突变后的半胱氨酸共价结合,可以将突变的K-RAS锁定在失活状态。在临床前研究中,MRTX849在阻断KRAS依赖性信号转导和癌细胞活力(EC50~10nM)方面具有很高的效力。与其他细胞蛋白相比,MRTX849KRAS G12C的抑制选择性也提高了1,000倍。在体内模型中,MRTX849在一组KRAS G12C阳性患者和细胞衍生肿瘤中显示出广谱抗肿瘤活性,在大多数模型中实现了明显的肿瘤消退。MRTX849在重复给药毒理学研究中表现出预测的人口服生物利用度> 30%和半衰期~20小时,以及高达10倍的治疗指数。

与先前报道的其他KRAS突变型选择性抑制剂相比,MRTX849似乎具有显著改善的效力和更高程度的抗肿瘤活性。此外安进公司的AMG510是第一款公布临床试验结果的KRAS G12C小分子抑制,AMG510具有良好的安全性和耐受性,并且在NSCLC患者中显示出可喜的疗效ASCO报道了AMG 510KRASG12C突变晚期实体瘤的I期临床试验结果:该项研究属于期临床研究,一共招募了22名患者,其中9名患者可供分析。这9名患者中,有5名是肺癌患者,4名是直肠癌患者。通过小分子抑制剂AMG510末线治疗后,有1例出现了部分缓解,6例病情稳定,还有2例出现病情发展,客观缓解率为11%。这个数据虽然非常低,不过总算是打开了历史性的缺口,让我们看到了降服KRAS突变的希望。

前面我们从几个典型的案例分析了蛋白磷酸酶、转录因子及原癌基因等传统难以成药靶标的药物开发是如何取得临床突破的。

我们可以总结一下这些靶标能够修炼成功主要依赖于以下几种策略:

1)对于针对这些难以成药的靶标的小分子药物开发来说大多是采用了一些间接策略,不直接作用于活性位点部位,而是共同作用于活性位点或周边的区域,将其目标蛋白锁定于失活构象。

2)这些先导化合物的最初获得有不少是通过表型筛选获得的,因此建立一些特殊的筛选模型和方法对于获得目标先导化合物至关重要。

3)采用一些间接的手段消除或降低靶标蛋白的表达,例如我们可以筛选针对mRNA的小分子化合物,使mRNA稳定性降低而降解,最终使相关蛋白的表达量降低,例如Expansion公司的Chem-CLIP™,Competitive Chem-CLIP™,Chem-CLEAVE™和Chem-CLICK™平台,它们可以评估小分子与靶标RNA的作用,以及评价相关的治疗方法。此外目前利用小分子降解难以成药靶标蛋白的PROTAC技术有望解决迄今为止被认为不易处理的癌症靶标。

(4)解决传统上不可成药靶标的另一个策略是避免使用小分子抑制剂,采用替代方法。这些替代方法包括小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。目前通过反义RNA或miRNA类似物来沉默相关蛋白靶标的表达的药物已经进入到临床。随着筛选技术和方法的进步和相关研究的不断深入,越来越多的不可成药的靶点将得以突破和成功开发,惠及广大的患者。

进入临床阶段的undruggabletarget的生物药

隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

进入临床阶段的undruggabletarget的小分子药

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参考文献
[1]Drugging the Undruggable: Therapeutic Potential of Targeting Protein Tyrosine Phosphatases. Acc Chem Res. 2017
[2]Drugging Undruggable Molecular Cancer Targets. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2016.
[3]PP1 Phosphatase Complexes: Undruggable No Longer. Cell 2018.
[4]Serine/Threonine Phosphatases:Mechanism through Structure. Cell 2009.
[5]Target-Based Discovery of an Inhibitor of the Regulatory Phosphatase PPP1R15B. Cell 2018.
[6]Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends Pharmacol Sci. 2017
[7]Mirati_ASCO_42x42_052819_PRINT.
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(作者:刘珠果 优选资本 来源:biotechventurecapital)

药物靶标具有更深层次的含义,它是指在正常或异常细胞中具有重要功能,可以与药物相互作用并产生临床疗效的分子,包括基因、受体、优选资本、 酶、离子通道、转运体、核酸等。纵观药物发现的历史,可以发现药物筛选是药物发现的基础,随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来,高通量高内涵的筛选方法得以开发,以基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、表观遗传学以及基因编辑等方法为基础的多种药物筛选和鉴定模型得以建立,越来越多的药物靶标得以发现。

通常我们把无法通过传统药物研发手段干预的蛋白靶点定义为难以成药的靶标。这些蛋白靶标多数位于细胞内大分子药物很难作用到,这些靶标蛋白在疾病的发生发展中发挥了重要的作用,因而十分重要但又很难成药,往往需要经过长期研究,尝试多种手段和方法后才能修炼成功。

诗人陆游的一句名句“山穷水复疑无路,柳暗花明又一村。”是这类靶标药物开发的真实写照。

传统意义上难以成药的靶标在肿瘤中更常见,根据靶标的成药性我们可以将癌症药物靶点分为两大类,一类是已经成药的靶点:如丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶、生长因子受体、GPCRs等。另一类是认为用传统的方法较难解决的一类靶标,主要包括原癌基因转录因子以及磷酸酶类。

这些靶标蛋白通常具有重要的生理功能,其功能失常通常和肿瘤发生密切相关,由于这几类靶点都是细胞内蛋白靶标,一直以来人们试图针对这些靶点开发小分子药物,但由于多种原因一直进展缓慢,随着近几年来方法手段及研究的深入,在这些难以成药靶点的药物开发上也有了较大的突破,针对这些靶点开发的小分子药物陆续进入到临床研究阶段,了解这类药物的成功开发经验对于我们开发同类难以成药靶点的药物具有重要的借鉴意义,下面我们从蛋白磷酸酶、原癌基因及转录因子靶点药物成功开发的案例看看难以成药靶标的修炼过程。(见下图)

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(黄色标注的是细胞外或细胞内的已经成药的一些靶点。红色标注的3类靶点是的药物开发相对滞后,通常认为是难以成药的靶点。图中的Y表示抗体。)

蛋白酪氨酸磷酸酶

蛋白酪氨酸磷酸酶PTPs)是细胞内一种必需的信号传导酶,他与蛋白酪氨酸激酶一起调节细胞内的酪氨酸磷酸化水平,维持正常水平的酪氨酸磷酸化对于细胞增殖,代谢,运动和存活十分重要。

PTP表达量的变化,调节失常和突变导致的异常酪氨酸磷酸化与癌症,糖尿病及肥胖症,自身免疫性疾病和传染病等多种人类疾病密切相关。长期以来PTP一直作为一个极具吸引力的药物靶标而备受关注,然而成功开发PTP的药物需要解决诸多问题具有较大的难度。

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简单总结一下PTPs难以成药的原因主要有以下3个方面:

1)PTP家族成员活性位点(即pTyr结合口袋)高度保守,打个形象的比喻就是PTP家族成员活性位点长像十分相似,很难加以识别;

2)PTP家族成员的活性位点区域带正电荷,更易于同带负电荷的分子结合,然而我们知道带负电的分子是很难透过细胞膜进入细胞内;

3)在带正电荷的活性位点环境中催化Cys的侧链以硫醇盐阴离子(pKa~5)存在,使其成为各种亲电试剂的主要靶标,这些亲电试剂包括以下几类:1)碘乙酰胺,马来酰亚胺,α-卤代羰基。2)氧化剂,包括过氧化氢,醌和菲蒽二酮3)重金属,如Zn2 +和Cu2+这些硫醇盐反应性分子通常会使高通量筛选的假阳性增加,从而增加获取目标化合物的难度。

如何化解这些难题呢?经过长期的研究和探索,发现采用基于片段的筛选方法,针对PTP活性位点和活性位点周边的非保守序列进行筛选的策略,可以提高PTP抑制剂的效力,选择性和生物利用度。

我们知道pTyr在PTP底物识别中具有重要作用,通过鉴定可有效占据活性位点口袋并不可水解的pTyr模拟物,并充分考虑pTyr侧翼的氨基酸残基对于有效的PTP底物转换的重要性,针对pTyr近端残基相互作用的活性位点边界的结合口袋设计抑制剂。

抑制剂通过产生与PTP活性位点和不同外周口袋相互作用的二价配体,通过靶向除活性位点之外的保守性较低的位点,可以使抑制剂亲和力和选择性大大增加。通过此种方式筛选获得的不可水解的pTyr模拟物具有足够的极性以结合PTP活性位点,而且仍然能够有效地穿透细胞膜。

Zhong-Yin Zhang分析了几个基于不可水解的pTyr模拟片段的方法靶向PTP活性位点和相邻的低保守口袋的成功案例,并证明此种方法在肿瘤,糖尿病及肥胖症,自身免疫和结核病动物模型中获得具有高亲和力,选择性和强大体内功效的PTP抑制剂是完全可行的。(见下图)

隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

(基于pTyr模拟片段的方法,用于靶向PTP活性位点和相邻较少保守的口袋,以提高抑制剂效力和选择性)

丝氨酸苏氨酸磷酸酶

蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶通过调节靶蛋白的去磷酸化,调节细胞的生长、增殖和分化,其表达或活性异常均可以引起细胞生物学行为改变。对蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂的研究有助于我们了解细胞生长、发育、调控的机制,寻找预防和治疗肿瘤的新途径。

早期的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂主要作为天然产物分离。这些具有多个手性位点的化学复杂分子,其天然产物相对于底物是混杂的,这使得它们在癌症治疗方面的开发成为一个挑战。

最近,一些癌症相关的Ser/Thr磷酸酶的开发取得了显著进展,下边我们和大家分享一下丝氨酸/苏氨酸磷酸酶家族的重量级成员PP1抑制剂的开发过程。

PP1磷酸酶广泛表达于所有真核细胞中并在细胞减数分裂、凋亡、蛋白质合成及代谢,细胞骨架重组以及膜受体和通道的调节过程中发挥了及其重要的作用。多种PP1的不同形式是与PP1磷酸酶的众多功能相适应的。然而,每种组装的功能性PP1酶具有严格的底物特异性并能引发特定的生物学反应。每种功能性PP1酶由催化亚基和调节亚基组成。PP1的催化亚基在所有真核生物中高度保守,大约具有70%以上的序列同源性,高度的同源性保证了催化亚基具有相同的蛋白折叠结构和激活位点。然而PP1的调节亚基数量众多,目前已经鉴定出至少100种PP1调节亚基,推测的PP1调节亚基的数量会更多。对已知不同真核生物谱系中调节亚基的分析表明,伴随着多细胞生物的进化过程,PP1调节亚基数量呈现爆炸式增长。这些调节亚基可以将PP1催化亚基靶向特定的亚细胞器并调节底物特异性,因此,催化亚基和特定调节亚基之间的相互作用是PP1功能的核心。

目前已知的大部分蛋白质磷酸化发生在丝氨酸和苏氨酸残基上,PP1磷酸酶的催化亚基PP1c参与了大多数丝氨酸/苏氨酸的去磷酸化,PP1c是一种单结构域蛋白,在细胞中不是游离的,而是全磷酸酶复合物的一部分。单纯针对PP1c的催化抑制剂不具有选择性,因为它们会抑制数百种全磷酸酶从而产生较大的毒性。对于这一难以成药靶标药物的开发也经历了较长的时间。

最初通过表型筛选发现了化合物Guanabenz和Sephin1可以选择性地抑制PP1c的调节亚基R15A,并且不显著抑制R15B PP1。Krzyzosiak根据相关研究推断针对R15B:PP1复合物而不是R15A可能是获得目标表型有效抑制剂的更好选择。为了实现这一目标,Krzyzosiak及其同事在表面等离子共振传感器芯片上重建了部分R15A / PP1和R15B-PP1全酶,并使用69个Ganabenz衍生物的小型文库进行了复合结合筛选,最终发现了一个化合物Raphin1,其结合R15B-PP1的选择性比R15A-PP1复合物高30倍。

在细胞实验中Raphin1增加eIF2a磷酸化并减少了蛋白质合成,而且在敲除R15B亚基后这些作用丧失,证实Raphin1的作用机制确实是通过R15B介导的。在动物实验中当以低至2mg / kg的剂量给予小鼠时,Raphin1以足够高的浓度积聚在包括脑的组织中以抑制R15B并且没有观察到相关的副作用发生。在亨廷顿氏疾病病小鼠模型中,Raphin1每天给予小鼠一次连续给药6周后,观察到不溶性亨廷顿蛋白聚集体的显著减少并显著延缓了疾病的发作。对于PP1全酶抑制剂的开发还可以采用其他一些方法,这些方法包括阻止PP1调节亚基与其生理底物接触或阻止调节亚基和催化亚基的相互作用,此外在某些PP1全酶上可能还存在其他与功能相关的关键口袋可以被利用。在未来的相关工作中,应该纳入定量总和磷酸化蛋白质组学分析(未在Krzyzosiak等人的研究中使用),以更好地表征已鉴定的PP1全酶抑制剂的体内特异性。

转录因子

众所周知各种癌症中相关基因转录及表达的异常和转录因子之间存在直接或间接的关系。早期发现的一些癌基因本身就作为转录因子(c-MYCSTAT3)或作为转录增强的信号起作用。

长期以来人们对开发修饰这些转录改变的策略存在浓厚的兴趣,转录因子形成蛋白质复合物,与DNA序列上的特定位点结合而启动基因转录。然而用小分子阻止核转录因子蛋白和DNA或共调节蛋白之间的功能性相互作用非常困难,因为参与这些相互作用的转录因子上的位点通常是大的,平坦的表面区域,这恰恰是与大多数酶或受体上发现的深的可药用结合口袋相反。

目前利用小分子抑制剂改变致癌转录事件的最佳开发策略是防止蛋白质之间的相互作用而不是破坏转录因子和DNA相互结合。下边我们看几个实例:

MYC-MAX

c-MYC是属于螺旋螺旋亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子,与几种蛋白质(包括MAX)形成高效的二聚体,是正常细胞增殖,代谢,分化和凋亡的主要调节因子。

长期以来,c-MYC被认为是抗癌药物靶标的希格斯玻色子,因为它在许多人类癌症中高表达和功能失调。然而人们很快认识到c-MYC几乎普遍参与正常的生理过程,人们担心c-MYC抑制会导致不可接受的毒性。

因为MYC蛋白质蛋白质相互作用(例如,MYC-MAXMYC-TRRAP)发生在一个相对较大,平坦且结构模糊的界面上,因此开发相关抑制剂具有较大的难度。

令人鼓舞的是,最近的研究揭示了干扰c-MYC转录或c-MYC-MAX二聚化的其他小分子工具化合物(例如,IIA6B17NY2267JY-3-094Mycro3),有了这些基础进一步开发其抑制剂主要是提高它们的特异性和亲和力。调节c-MYC的几种挑衅性替代方法正在出现。Omomyc,一种MYC显性负肽,从其二聚化配偶体(例如MAXMIZ-1)中螯合c-MYC,选择性地阻止MYC依赖性转录激活。

Omomyc在肺癌和胶质瘤的临床前小鼠模型中显示出有效的抗肿瘤活性。间接靶向MYC作为抗癌治疗策略来自BET溴结构域小分子抑制剂的研究,其通过干扰MYC调节辅助因子的乙酰基赖氨酸识别结构域有效抑制MYC基因表达。目前多个BET溴结构域抑制剂已经进入到临床一期阶段。

有趣的是,MAX同源二聚体的小分子稳定剂也通过干扰MYC-MAX的异二聚化作为MYC信号传导的潜在抑制剂。另外一种替代策略是采用c-MYC siRNADCR-MYC)的脂质纳米颗粒制剂抑制c-MYC翻译和随后的蛋白质表达,这可以导致肿瘤细胞生长的减少。

P53

P53是大家十分熟悉的一个难以成药靶点,TP53是人类癌症中最常见的突变基因,它编码肿瘤抑制转录因子p53,它是DNA修复,代谢,细胞周期停滞,细胞凋亡和衰老过程的关键调节因子。研究证实p53的缺失或突变会加剧宿主细胞基因组的不稳定性,增加患癌风险,并且增加肿瘤发生后癌细胞的侵袭迁移和耐药能力,因此,它一直是最受追捧的分子癌靶点之一。p53虽是研究最为深入的癌症相关基因,但相关药物的开发却较慢,这与p53突变的复杂性有很大关系。

针对不同的突变型p53主要有以下2种策略:直接作用于突变型的p53,包括恢复野生型p53的活性及诱导突变型p53的降解;另外一种策略则是间接作用于突变型的p53蛋白,可以通过靶向p53突变的癌变细胞信号通路或靶向G2/M期检查点。

目前利用直接作用于突变型的p53策略开发的抑制剂有多个进入临床早期研究阶段,其中比较火的是针对p53-MDM2相互作用开发相关的抑制剂,MDM2体内最重要的作用是抑制野生型p53的激活转录功能和抗肿瘤活性,基因敲除实验发现MDM2基因完全缺失的小鼠不能存活,而p53MDM2都缺失的小鼠则能存活,故而这种抑制作用在胚胎发育的最早期就存在,所以有人将MDM2称作p53大哥,很多证据表明MDM2是癌基因,因此设计小分子抑制剂干扰p53-MDM2的相互作用能够达到多重效果。

癌基因

癌基因的种类很多,下边我们看一个明星分子原癌基因RASRas蛋白是一类大小为21kD左右的单体三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白,为原癌基因RAS的表达产物,其存在于人类的大部分细胞中,能够结合GTP并且具有较弱的GTP水解酶活性。

人类三种RAS原癌基因能够编码出四类Ras相关蛋白:N-RasH-RasK-Ras4AK-Ras4B其中K-Ras4B蛋白在肿瘤病人体内是突变率最高的一类亚型蛋白。RAS被认为是人类第一个发现的突变致癌基因,RAS是一种非常珍贵的抗癌药物靶点不可否认,大量研究证据表明,多达30%的肿瘤样本中存在RAS基因突变,在四种最致命的人类恶性肿瘤中的三种:结肠癌、肺癌和胰腺癌中都存在RAS基因突变。

虽然经过30年的深入研究,开发临床可行的RAS抑制剂一直进展缓慢,这给大家形成一个普遍的印象即RAS癌蛋白是不可成药的,与许多其他难以成药靶点一样,RAS蛋白表面缺乏深的、适合药物作用的疏水囊,这大大阻碍了高亲和力抑制剂的开发,目前发现了一些低亲和力抑制剂,但这些抑制剂都缺乏效力或存在一些不良影响。

ras蛋白的激活同时受到时间和空间调控,早期人们希望间接控制其空间调控来阻断ras蛋白的活性,最初是开发了针对翻译后修饰HRAS的法尼基化转移酶抑制剂,但是临床试验结果令人失望,因此可能同时阻断法尼基转移酶和香叶转移酶1才可能有一定作用,但由于这些酶有数百种其他底物,这就产生了对可能的靶外效应的担忧。

直到最近RAS抑制剂的临床开发终于有所突破,Mirati Therapeutics(MRTX)公司成功开发了针对K-RASG12C突变的小分子抑制剂MRTX849,该抑制剂主要同12号密码子突变后的半胱氨酸共价结合,可以将突变的K-RAS锁定在失活状态。在临床前研究中,MRTX849在阻断KRAS依赖性信号转导和癌细胞活力(EC50~10nM)方面具有很高的效力。与其他细胞蛋白相比,MRTX849KRAS G12C的抑制选择性也提高了1,000倍。在体内模型中,MRTX849在一组KRAS G12C阳性患者和细胞衍生肿瘤中显示出广谱抗肿瘤活性,在大多数模型中实现了明显的肿瘤消退。MRTX849在重复给药毒理学研究中表现出预测的人口服生物利用度> 30%和半衰期~20小时,以及高达10倍的治疗指数。

与先前报道的其他KRAS突变型选择性抑制剂相比,MRTX849似乎具有显著改善的效力和更高程度的抗肿瘤活性。此外安进公司的AMG510是第一款公布临床试验结果的KRAS G12C小分子抑制,AMG510具有良好的安全性和耐受性,并且在NSCLC患者中显示出可喜的疗效ASCO报道了AMG 510KRASG12C突变晚期实体瘤的I期临床试验结果:该项研究属于期临床研究,一共招募了22名患者,其中9名患者可供分析。这9名患者中,有5名是肺癌患者,4名是直肠癌患者。通过小分子抑制剂AMG510末线治疗后,有1例出现了部分缓解,6例病情稳定,还有2例出现病情发展,客观缓解率为11%。这个数据虽然非常低,不过总算是打开了历史性的缺口,让我们看到了降服KRAS突变的希望。

前面我们从几个典型的案例分析了蛋白磷酸酶、转录因子及原癌基因等传统难以成药靶标的药物开发是如何取得临床突破的。

我们可以总结一下这些靶标能够修炼成功主要依赖于以下几种策略:

1)对于针对这些难以成药的靶标的小分子药物开发来说大多是采用了一些间接策略,不直接作用于活性位点部位,而是共同作用于活性位点或周边的区域,将其目标蛋白锁定于失活构象。

2)这些先导化合物的最初获得有不少是通过表型筛选获得的,因此建立一些特殊的筛选模型和方法对于获得目标先导化合物至关重要。

3)采用一些间接的手段消除或降低靶标蛋白的表达,例如我们可以筛选针对mRNA的小分子化合物,使mRNA稳定性降低而降解,最终使相关蛋白的表达量降低,例如Expansion公司的Chem-CLIP™,Competitive Chem-CLIP™,Chem-CLEAVE™和Chem-CLICK™平台,它们可以评估小分子与靶标RNA的作用,以及评价相关的治疗方法。此外目前利用小分子降解难以成药靶标蛋白的PROTAC技术有望解决迄今为止被认为不易处理的癌症靶标。

(4)解决传统上不可成药靶标的另一个策略是避免使用小分子抑制剂,采用替代方法。这些替代方法包括小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。目前通过反义RNA或miRNA类似物来沉默相关蛋白靶标的表达的药物已经进入到临床。随着筛选技术和方法的进步和相关研究的不断深入,越来越多的不可成药的靶点将得以突破和成功开发,惠及广大的患者。

进入临床阶段的undruggabletarget的生物药

隙穴之窥-难以成药靶标修炼记

进入临床阶段的undruggabletarget的小分子药

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参考文献
[1]Drugging the Undruggable: Therapeutic Potential of Targeting Protein Tyrosine Phosphatases. Acc Chem Res. 2017
[2]Drugging Undruggable Molecular Cancer Targets. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2016.
[3]PP1 Phosphatase Complexes: Undruggable No Longer. Cell 2018.
[4]Serine/Threonine Phosphatases:Mechanism through Structure. Cell 2009.
[5]Target-Based Discovery of an Inhibitor of the Regulatory Phosphatase PPP1R15B. Cell 2018.
[6]Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends Pharmacol Sci. 2017
[7]Mirati_ASCO_42x42_052819_PRINT.
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