冉冉新星，药企新宠！—— PROTAC靶向蛋白降解技术浅析

原文始发于微信公众号（药时代）：冉冉新星，药企新宠！—— PROTAC靶向蛋白降解技术浅析

撰文 |紫薯

2018年1月28日

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2015年4月7日，默沙东4.3亿

2017年11月15日，基因泰克6.5亿

2018年1月5日，辉瑞8.3亿

药企巨头齐聚Arvinas，一致看好它的蛋白降解平台, PROTAC （proteolysis-targeting chimeras），技术主要来自耶鲁大学Craig Crews 实验室。

诱导蛋白水解新锐还有C4 Therapeutics（平台技术Degronimid）。创始人之一为原Harvard/Dana-Farber的Jay Bradner，现在掌舵诺华研发NIBR。

PROTAC技术简介

传统的药物研发主要集中在直接调控蛋白质或酶的活性来治疗疾病。蛋白质活性调节剂，特别是抑制剂的开发和应用一直是药物研发的主流方向。通过影响蛋白表达来控制蛋白质功能的基于核酸的策略最近取得突破，开始进入临床并得到重视。然而，代谢稳定性较差和生物利用度不高限制了小分子核酸技术更为广泛的应用。

PROTAC是17年前发明的技术 (2001年)，该技术利用了细胞内的“清洁工”——泛素-蛋白酶体系统。泛素-蛋白酶体系统正常生理功能负责清理细胞中变性、变异或者有害的蛋白。PROTAC利用细胞自身的蛋白质破坏机制来从细胞中去除特定致癌蛋白，是一种靶向治疗的替代方法。

PROTAC近几年因为在几个蛋白尤其是BET族蛋白、激素受体等成功获得高细胞活性和较好的药代性质而开始成为整个制药业关注的焦点。

和传统蛋白抑制剂作用原理不同，PROTAC平台技术是一个双功能杂合化合物，一边用来结合目标蛋白，另一边用来结合一个E3连接酶，使得目标蛋白可以与E3连接酶结合，把目标蛋白泛素化，从而被蛋白组降解。理论上PROTAC只是提供结合活性，是事件驱动“event-driven”，区别于传统的占有驱动“occupancy-driven”，不需直接抑制目标蛋白的功能活性，又可以重复利用，所以业界认为对PROTAC的活性要求也许不用很高。

过去的2017年是PROTAC平台技术成熟跃进的一年，Crews也在各种期刊杂志上发表了超过10篇综述性文章，从各个角度总结了PROTAC的进展及应用前景。同时，Crews还作为药物化学杂志（JMC）的特邀编委，于2017年底出了一个PROTAC的专刊。

PROTAC技术发展历程及靶点选择

PROTAC技术经常被归类在所谓的不可成药的靶点（undruggable），比如转录因子、蛋白的骨架功能、调控功能等。作为研究工具，探索高难度不可成药的靶点无可厚非，还非常有意义，但是要开发临床药物，突破点还是应该首选一些经过验证的靶点，降低变量，首先证明PROTAC的可行性。这也是过去几年PROTAC的重点攻关方向。

PROTAC可以说是诱导蛋白降解技术的一种改进的、通用的平台技术。在此之前，已经有一些类似的技术和它的原型版，如最早发现的一些自带降解功能的选择性激素受体抑制剂、HyT 技术等。

Timeline of the induced protein degradation field

• 激素受体抑制剂

选择性的雌激素受体抑制剂如tamoxifen（selective estrogen receptor modulator (SERM)）最早于1977年获FDA批准用于治疗ER+的乳腺癌患者，疗效显著。而改进版的SERM fulvestrant (ICI82780, Faslodex; AstraZeneca) 意外而幸运地发现自带降解雌激素受体的功能。这也是最早报道的诱导降解蛋白技术的原型。虽然fulvestrant没有口服活性，PK也很差，但因为能够降解雌激素受体，使得它成为迄今唯一获批用于二线Tamoxifen等耐药的乳腺癌患者（2002年获得FDA批准），推测克服耐药的主要贡献来自其诱导降解雌激素受体的能力。改进fulvestrant成药性的尝试一直还没有重要进展。

同样，寻找靶向前列腺癌的fulvestrant类似物的尝试也一直在继续，即选择性靶向雄激素受体的降解剂（selective androgen receptor degraders (SARDs)）。

目前来看，基于SARDs和SERDs的小分子降解剂仅限于雌、雄激素受体，难以开发成通用的技术平台。

• 疏水性标签HyT

为了将诱导蛋白质不稳定性的概念扩展到更大范围的蛋白质靶标，最近Crews和其它的实验室开发了一种新的技术平台：疏水性标签（hydrophobic tagging ，HyT）。

类似于fulvestrant诱导的表面疏水性，该方法将疏水性部分（即金刚烷adamantane或Boc3-Arg）附加到靶蛋白的表面上，试图模拟部分未折叠的蛋白状态，并利用胞质未折叠蛋白响应系统来降解靶标。

2012年证明了Boc3-Arg诱导蛋白降解的能力，通过共价抑制剂etacrynic acid与Boc3-Arg连接靶向降解谷胱甘肽-S-转移酶α1（GST-α1）。类似地，使用微摩尔浓度的与Boc3-Arg偶联的非共价抑制剂甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim）可以降解二氢叶酸还原酶。

尽管详细的分子伴侣或其他控制途径的作用机制仍然未知，但是已知这种诱导靶向蛋白降解途径是通过独立于蛋白酶体泛素和ATP的方式发生的。

• 基于肽段的PROTAC技术

在2001年最早发表的几个概念验证实验中，Crews实验室与合作者Ray Deshaies报道了第一批PROTACs双功能分子：泛素 – 蛋白酶体系统，通过招募E3连接酶到靶标蛋白质，导致邻近诱导的泛素化和随后的蛋白质降解。最初的技术是基于短肽段的PROTAC技术，成功的靶标包括MetAP2、雄激素受体、芳烃受体、PI3K等。

然而，这些肽类PROTAC的活性较低，依然停留在微摩尔范围内，主要障碍可能在于肽段技术平台具有较差的细胞渗透率。幸运的是，不断的改进尝试促进了具有体内稳定性的PROTAC小分子技术平台的发展。

• 小分子PROTAC

最早的报道是2008年，利用MDM2与P53的小分子抑制剂来自罗氏的Nutlin3，连接到E3 连接酶MDM2来降解雄激素受体。细胞活性浓度达到微摩尔，后来经过多番尝试，仍旧不能进一步有效提高其细胞活性。

接下来是基于cIAP1 E3连接酶的PROTAC技术，利用cIAP1抑制剂bestatin，交联多个目标靶点的小分子，包括ER、AR、ATRA、TACC3 等。但由于bestatin本身选择性不高，活性也欠缺，多个嵌合的PROTAC小分子活性均不够高，尚没有候选物进入动物实验。

最近的努力在于用小分子化合物取代VHL E3连接酶的结合肽段HIFa-1。突破发生在2015年，终于得到了纳摩尔细胞活性的PROTAC小分子，用来降解雌激素相关受体α (ERRα)，RIPK2等。体内动物模型显示，ERRα的降解可以发生在心脏、肾脏和肿瘤异种移植物中，大约40％的靶标蛋白能够被降解。

2010年， Handa及其同事的研究发现E3连接酶Cereblon（CRBN）为沙利度胺蛋白质的主要靶点。考虑到邻苯二甲酰亚胺结合CRBN的能力，Crews实验室和其他人试图利用邻苯二甲酰亚胺作为E3连接酶募集配体来劫持CRBN以降解目标蛋白质。小分子BRD4结合部分（OTX015）与pomalidomide的缀合产生能够在皮摩尔效能下降解表观遗传调节物BRD4的PROTAC。

与BRD4抑制剂JQ1和OTX015相比，基于CRBN的PROTAC通过抵消已知与BRD4抑制相关的的反馈BRD4表达增加，从而能够更持久地抑制c-myc的表达水平。在细胞水平，这种持续抑制导致了对Burkitt’s淋巴瘤细胞系优异的抗增殖和凋亡作用。在一个研究中，BRD4抑制剂JQ1与沙利度胺衍生物结合，由此产生的PROTAC，称为dBET1，能够在低纳摩尔浓度下诱导BRD4降解。对此PROTAC的蛋白质组学研究表明该化合物显着降低了c-myc、BRD2、BRD3和BRD4水平，同时具有较小的脱靶降解效应。

dBET1在白血病的动物模型中也显示良好的活性，临床前模型中的药理学也令人鼓舞，为人体临床实验奠定了基础。

除了基于CRBN的PROTAC之外，研究人员还开发了皮摩尔的基于VHL的pan-BET-靶向PROTAC，其与BET抑制剂相比表现出优异的抗细胞增殖活性。 pan-BET-靶向PROTAC也显示出针对22RV-1CRPC小鼠异种移植物的活性，因此扩大了PROTAC技术在实体瘤恶性肿瘤中的应用。

Compounds that degrade their respective targets without requiring any genetic manipulation

Protein ssuccessfully targeted for degradation

2013年成立的Arvinas自己的管线开发目前专注于针对前列腺癌和乳腺癌的雄激素和雌激素受体降解。去年11月，它命名了靶向并诱导雄激素受体蛋白降解的首款临床候选药物ARV-110 ，12月，命名了靶向并诱导雌激素受体蛋白降解的第二款候选药物ARV-378。而在2017年底圣安东尼奥召开的乳腺癌年会上，Arvinas报道了其新的雌激素受体 PROTAC临床前效果好于fulvestrant ，并且与CDK4/6的抑制剂有良好的组合增效作用。拥有重磅新药Ibrance的辉瑞坐不住了，马上砸钱合作（仅为推测合作靶点）。

C4 Therapeutics成立于2015年，主要专注于自己的技术平台Degronimid™，BRD4，调控基因组转录活性的靶点，如MYC 。得益于Jay Bradner的大力推广及无偿提供JQ1，积极参与JQ1类似物研发的药企名单很长，包括：GSK、Merck、AbbVie、Gilead、Incyte、BMS、Forma、Zenith等等。

PROTAC技术潜在优势、缺点

Craig Crews最近总结了PROTAC与其它技术的区别，满满都是正能量 （Yes we can）。

PROTAC 在很大程度上是结合了小分子化合物和小分子核酸的优点。即可以有效地靶向目标蛋白，又可以将之降解清除，想象空间非常丰富。如表示：

当然PROTAC的硬伤也有，比如分子通常很大，PK是一个主要障碍。虽然现在已有体内活性PROTAC化合物的报道，甚至今年就会进入人体临床研究。但总体而言，PK 仍旧是多数PROTAC小分子成药的主要障碍。化学合成也困难得多，CMC是一个很大的挑战。

脱靶毒性应该也是大家最为担心的问题之一。传统靶向蛋白活性的小分子、大分子药物，甚至小核苷酸，一般来讲对蛋白活性的抑制不会太彻底，也多不影响骨架蛋白的表达，这样固然增加了耐药性发生的概率，但同时残留的活性也可能保障了正常细胞、组织器官基本的生理活性，降低了潜在毒性。而PROTAC作为更为彻底靶标降解者，即使是以前验证过的靶点，会不会带来更为严重的毒性，需要在未来的临床实验中密切监视。

另一个隐患是降解的脱靶效应在临床前毒性筛选中不易检测、跟踪，增加了后期开发的风险。

小结——机遇与挑战

基于核酸的降解疗法曾被寄予厚望，特别是理论上能够靶向常规药物难以施展的疾病靶标。但由于肝脏毒性、递送手段及体内药代等种种局限，小分子核酸技术短期内仍旧难以大范围推广使用。而传统小分子药物经过多年的发展，也出现严重的发展瓶颈，需要技术上的突破来提升效率。而PROTAC小分子技术平台结合了小分子核酸和传统小分子化合物药物的优点，在技术上是一个极大的突破，具有广阔的发展想象空间。

传统的靶向细胞内的经典靶点多可以作为PROTAC技术平台的试金石，如雌、雄激素受体、蛋白激酶等。过去的两年，PROTAC小分子技术在提高细胞活性、口服活性、临床前动物实验上取得重要进展，Arvinas已经于去年选定两个临床实验小分子PROTAC。PROTAC小分子既可以单用于克服传统靶向药耐药性，也是将来一个组合疗法的利器，前景非常值得期待。

PROTAC小分子研究最近的突破还主要集中在可靶向的靶点上。它的未来最大潜力之一是要靶向传统不可靶向的靶点，比如转录因子、蛋白的骨架功能等，或是不可成药的靶点之王KRAS突变。高达20-30%的肿瘤中含有KRAS突变，包括90%以上的胰腺癌、50% 的结肠癌、30%的肺癌等。PROTAC技术平台能够在对KRAS的冲锋中给我们带来惊喜吗？我们拭目以待！

Is the PRIME time coming for PROTAC?

Is PROTAC breaking THE rules or just making NEW ones?

临床见真章

参考文献：

1. The Advantages of Targeted Protein Degradation Over Inhibition: An RTK Case Study.Burslem GM, Smith BE, Lai AC, Jaime-Figueroa S, McQuaid DC, Bondeson DP,Toure M, Dong H, Qian Y, Wang J, Crew AP, Hines J, Crews CM. Cell Chem Biol.2017 Oct 25. pii: S2451-9456(17)30353-7. doi: 10.1016/j.chembiol.2017.09.009.[Epub ahead of print]

2. Inducing Protein Degradation as a Therapeutic Strategy. Crews CM. J Med Chem. 2017 Nov 22. doi:10.1021/acs.jmedchem.7b01333. [Epub ahead of print]

3. Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones? Churcher, I. J. Med. Chem. 2017,10.1021/acs.jmedchem.7b01272.

4. Regulating the Master Regulator:Controlling Ubiquitination by Thinking Outside the Active Site. Paiva, S. L.; da Silva, S. R.; de Araujo,E. D.; Gunning, P. T. J. Med. Chem. 2017, 10.1021/acs.jmedchem.6b01346.

5. Targeted protein knockdown using small molecule degraders. Curr Opin Chem Biol. 2017 Aug;39:46-53. doi:10.1016/j.cbpa.2017.05.016. Raina K, Crews CM.

6. Waste disposal-An attractive strategy for cancer therapy. Salami J,Crews CM. Science. 2017 Mar 17;355(6330):1163-1167. doi:10.1126/science.aam7340.

7. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Lai AC, Crews CM. Nat Rev Drug Discov. 2017Feb;16(2):101-114. doi: 10.1038/nrd.2016.211.

PROTAC技术突破之三剑客

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作者： 紫薯

出处： 药时代（ID：drugtimes）

编辑：Walker 配图：网络

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