Science：靶向突变KRAS与分子伴侣蛋白的活性状态

RAS有RAS-ON（与GTP结合）和RAS-OFF（与GDP结合）两种状态，它的突变很常见，与很多疾病相关，是一个非常热门的肿瘤靶点。

其中KRAS G12C突变是非小细胞肺癌（NSCLC）中最常见的KRAS突变，目前只有两款靶向KRAS G12C非活性状态的抑制剂Sotorasib和Adagrasib获批上市，然而它们临床疗效和市场销售都不及预期，可能因为它们是抑制KRAS-OFF状态。

近期，Christopher等人在Science上发表了基于天然产物Sanglifehrin A改造而来的化合物RMC-4998和RMC-6291作用于活性状态的KRAS G12C蛋白，它们在临床前试验中表现良好的药效和选择性，目前RMC-6291正在进行一项单药治疗晚期 KRASG12C 突变实体瘤患者的 1 期临床扩展研究（NCT05462717）。

KRAS蛋白和获批上市抑制剂

KRAS是一种小鸟苷三磷酸酶（GTP酶），在无活性[鸟苷二磷酸（GDP）结合，OFF]状态和活性（GTP结合，ON）状态之间循环。活性KRAS结合并激活几种效应蛋白以调节细胞生长和增殖（图1）[1]。

KRAS是一种容易突变的蛋白，它的突变作为致癌驱动因素刺激过多的下游信号传导和增殖。KRAS突变有多种类型，包括G12C、G12V、G12D等，其中KRAS G12C突变是非小细胞肺癌（NSCLC）中最常见的KRAS突变。

图1. KRAS蛋白状态和突变

在过去几十年里，KRAS由于结构特点和与GTP或GDP的结合非常强等原因一度被认为不可成药。直到2021年5月28日，第一个针对KRAS G12C的抑制剂Sotorasib（Lumakras，AM510）被美国FDA加速批准上市才打破僵局，随后2022年12月FDA批准了第二款KRAS G12C抑制剂Adagrasib（Krazati，MRTX849）上市，都是用于治疗KRAS G12C的NSCLC患者。

但是这两个化合物都是作用于KRAS的失活状态，可能是因为这个原因，它们临床疗效并没有很好，上市后销售不佳，Sotorasib今年上半年销售额只有1.51亿美元，低于分析师的期望值。

基于天然产物Sanglifehrin A结构改造

Christopher等人首先关注到分子伴侣蛋白亲环蛋白A（CYPA），因为其与KRAS效应子结合界面上的残基具有良好的静电表面电荷互补性[2]。Sanglifehrin A是一种天然产物，可以高亲和力结合CYPA。

他们基于Sanglifehrin A改造得到化合物1，基于CYPA：化合物1：KRASG12C三复合物的晶体结构（图2A），对化合物1进行大环化结构改造，所得环化核心用乙酰胺部分修饰实现可逆结合得到化合物2或用丙烯酰胺弹头以共价接合C12残留物得到化合物3（图2B）。

图2. A. CYPA：化合物1：KRASG12C三复合物的晶体结构；B. 化合物1和后续优化的化合物结构，其中sanglifehrin衍生的CYPA结合部分以蓝色显示

分子活性测定显示化合物2诱导的CYPA复合物与鸟苷-5′-[（b，g）-酰亚胺基]三磷酸（GMPPNP）结合的野生型KRAS（KRAS WT）以及 KRAS G12C的IC₅₀分别为510或180 nM（图3A）。相比之下，化合物3具有诱导CYPA复合物的效力增加，对KRAS G12C的IC₅₀为52 nM，同时保持与KRAS WT的弱可逆结合（IC₅₀：520 nM）。

对化合物3进行修饰，以进一步提高KRAS G12C的选择性，用炔酰胺连接链替换化合物3中的丙烯酰胺得到化合物4（图2B），对KRAS G12C-CYPA三复合物形成具有更高的效力和选择性（IC₅₀：28 nM，选择性大于39倍，图3A）。

他们进一步优化弹头和接头得到化合物RMC-4998，RMC-4998的共价结合效率[酶失活速率常数（kinact）与抑制常数（KI）之比：272，000 M⁻¹ s⁻¹（kinact/KI）：272，000 M⁻¹ s⁻¹] 大于现有非活性状态选择性抑制剂，RMC-4998 靶向 KRAS G12C的活性或鸟苷三磷酸（GTP）结合状态。RMC-4998可逆地绑定到CYPA上形成低亲和力二元复合物[解离常数（Kd）= 1.09 mM，解离速率常数（koff）= 1.0 s⁻¹，图3C]。

图3. A. 在化合物浓度增加的情况下，KRAS蛋白（50nM）和CYPA（20mM）之间的相互作用通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）；B. 在CYPA（25 mM）和指示化合物（平均值）存在下对KRAS G12C共价修饰的速率（kobs）；C. RMC-4998形成三络合物的示意图以及每个反应的速率常数。

RMC-4998与KRAS的晶体结构以及结合活性

通过解析RMC-4998与KRAS的晶体结构，发现RMC-4998保留了化合物1的哌嗪酸和肽接头以维持与Q63和N102主链的相互作用，但RMC-4998大环中的取代吲哚引入了与R55的额外阳离子-p相互作用以及许多有利的疏水接触（图4）。通过这些相互作用，RMC-4998重塑了CYPA的分子表面，以创建与KRASG12C具有亲和力的新形态界面（图4）。

图4. RMC-4998与KRAS的晶体结构

晶体结构叠加表明，当CYPA结合在三复合物中，可阻断催化亚基RAS G12C的效应子结合界面，包括CRAF的RAS结合结构域和富半胱氨酸结构域（分别为RBD和CRD）、PI3K的催化亚基p110、SOS1催化区域的变构位点和RAL鸟嘌呤核苷酸解离刺激器的RAS相互作用结构域（RID）（图5A）。

CYPA：RMC-4998：KRASG12C三复合物的形成导致BRAF RBD和RALGDS RID从突变KRAS中浓度依赖性解离（图5B）。在活细胞动力学测定中，加入RMC-4998导致KRAS G12C与CYPA的快速结合，这一效应与全长CRAF与KRASG12C的解离平行（图5C和D）。

通过比较在CYPA-null细胞和正常表达的细胞中RMC-4998对CYPA结合活性可以发现CYPA对于RMC-4998的抑制是必不可少的（图5B），相比之下，CYPA丢失对非活性状态选择性KRASG12C抑制剂Adagrasib的细胞活性没有影响（图5B）。

图5. RMC-4998与活性KRAS G12C形成三复合物和活性测定

选择性抑制致癌信号传导和扩散

RMC-4998在KRAS G12C突变癌细胞模型中破坏效应子结合，从而抑制了下游ERK信号传导，IC₅₀范围在1至10 nM之间（图6A）。RMC-4998处理还减弱了AKT-MTOR和RAL信号传导。

与非活性状态选择性抑制剂Adagrasib（1mM）和Sotorasib（10mM）相比，GTP-KRAS G12C与三复合物抑制剂RMC-4998（0.1 mM）导致KRAS G12C和 CRAF之间的相互作用更快地中断（图6B）。

非活性状态选择性抑制剂的另一个局限性是它们对细胞的敏感性驱动核苷酸交换以诱导KRAS G12C的GTP负载的刺激。这在受体酪氨酸激酶后尤其明显（RTK）激活。暴露于表皮生长因子（EGF）或肝细胞生长因子（HGF）导致非活性状态选择性抑制剂Adagrasib的靶标接合、ERK抑制和抗增殖作用减弱（图6C）。

图6. RMC-4998抑制信号通路和细胞增殖

细胞系和患者来源的异种移植物中具有强大的抗肿瘤活性

RMC-4998的进一步优化导致了RMC-6291，一种活性状态选择性KRAS G12C抑制剂目前正在进行临床试验。RMC-4998和RMC-6291具有相似的化学结构和几乎相同的对KRAS G12C结合动力学常数活性（图7）。

Science：靶向突变KRAS与分子伴侣蛋白的活性状态

图7. RMC-6291的结构

在癌细胞系中，RMC-6291抑制KRAS G12C突变细胞增殖的IC₅₀为0.11 nM的，比非G12C突变模型强13,500倍，表明其选择性好，RMC-4998的IC₅₀为0.28 nM，有1450倍选择性（图8A）。

携带NCI-H358异种移植物的小鼠每日口服RMC-6291耐受性良好，并导致接近完全肿瘤消退（图8B）。RMC-6291 获得剂量依赖性血浆浓度和抑制下游信号输出，通过对肿瘤DUSP6 mRNA的影响进行评估（图8C）

接下来，他们评估了RMC-6291在一组KRASG12C突变NSCLC和结直肠癌（CRC）的细胞系衍生（CDX）和患者来源（PDX）异种移植模型中的抗肿瘤活性。在标准的28天治疗期后，RMC-6291治疗导致76%（19/25）的NSCLC模型和40%（6/15）的CRC模型的肿瘤消退（图8D和E）。

这些结果表明，RMC-6291在临床前研究中的每日口服给药可以引起抗肿瘤反应。

图8. RMC-4998和RMC-6291抑制细胞和肿瘤生长

小结

KRAS的突变在很多疾病中很常见，是一个热门的肿瘤靶点，目前只有两款KRAS G12C抑制剂Sotorasib和adagrasib获批上市，然而它们临床和市场表现都不是很好，可能因为它们是抑制非活性状态的KRAS蛋白。

RMC-4998和RMC-6291是由Revolution Medicines基于天然产物Sanglifehrin A改造而来的抑制活性状态KRAS G12C蛋白的抑制剂，它们在临床前数据表现很好的分子和细胞活性、选择性以及在小鼠体内也有很好的抗肿瘤活性，目前RMC-6291正在进行临床1期试验。

References

1. Daniel Zeitouni, Yuliya Pylayeva-Gupta, Channing J. Der * and Kirsten L. Bryant, KRAS Mutant Pancreatic Cancer: No Lone Path to an Effective Treatment, Cancers 2016, 8, 45

2. Christopher J. Schulze, Kyle J. Seamon, Yulei Zhao, Yu C. Yang, Jim Cregg, Dongsung Kim, Aidan Tomlinson, Tiffany J. Choy, Zhican Wang, Ben Sang, Yasin Pourfarjam, Jessica Lucas, Antonio Cuevas-Navarro, Carlos Ayala-Santos, Alberto Vides, Chuanchuan Li, Abby Marquez, Mengqi Zhong, Vidyasiri Vemulapalli, Caroline Weller, Andrea Gould, Daniel M. Whalen, Anthony Salvador, Anthony Milin, Mae Saldajeno-Concar, Nuntana Dinglasan, Anqi Chen, Jim Evans, John E. Knox, Elena S. Koltun, Mallika Singh, Robert Nichols, David Wildes, Adrian L. Gill, Jacqueline A. M. Smith, Piro Lito, Chemical remodeling of a cellular chaperone to target the active state of mutant KRAS, Schulze et al., Science 381, 794–799 (2023)