HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

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HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

 

 

摘要

 

 

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

目前,我们对获得性免疫检查点抑制剂(ICI)耐药的机制知之甚少。有文献报道,黑色素瘤PD-1抑制剂治疗中获得性耐药机制与肿瘤细胞非同义突变减少、β2微球蛋白缺失/突变介导的HLA I类分子抗原处理缺陷以及JAK1/2失活突变介导肿瘤细胞干扰素(IFN)信号缺陷相关。但肺癌免疫检查点抑制剂耐药机制不明,基于此,Katerina Politi团队入组14例患者,通过研究HLA-I类抗原处理和提呈机制(APM)组件的基因改变来判断是否对PD-1PD-L1抗体获得性耐药。结果表明,HLA-I类分子抗原提呈机制的破坏可导致肺癌免疫检测抑制剂耐药。
 
1.免疫检查点抑制剂肿瘤耐药的基因表达情况
为了确定与获得性ICI耐药相关的细胞和分子机制,Katerina Politi团队系统地分析了2011至2016年间在机构内治疗ICI耐药的非小细胞肺癌NSCLC)患者,入组14例,在使用PD-1治疗前及产生耐药时采集可用的肿瘤样本进行了全外显子组DNA测序(图1)。
 

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因
图1 获得性耐药ICIs病例分析过程特点。A.14例入组患者重复活检及样本分析示意图;B.不同患者的免疫治疗方案;C.单个病人对免疫治疗的应答时间,对ICIs的耐药和治疗时间点
 

作者研究了肿瘤样本体细胞非同义(NS)突变的数量ICI耐药前后是否发生变化,结果发现在ICI获得性耐药8个病例中有6例标本NS突变负荷增加。为了评估ICI耐药样本中肿瘤新抗原可能发生改变,他们通过相关软件预测肿瘤样本了肿瘤新抗原的HLA限制性的数量,发现候选肿瘤新抗原的数量与体细胞突变的数量普遍相关,8个获得性耐药病例中有6例增加(图2)。

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

图2 患者样本ICIs获得性耐药的突变景观。A.体细胞突变负荷;B.肿瘤新抗原负荷

2.ICIs耐药时β2M微球蛋白缺失

黑色素瘤结直肠癌派姆单抗耐药的病例中发现HLA-I类抗原的处理和提呈存在缺陷。为确定患者样本队列中是否存在编码HLA-Ⅰ类分子APM机制的基因遗传缺陷,作者调查了72个与抗原处理和提呈相关基因(http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?hsa04612)。基因拷贝数变异分析显示,ICI耐药样本中具有获得性突变的基因:PSMD13、CD207、PSMD4、PSMD7和PSMD1,但未发现这一途径中基因的反复突变和/或拷贝数改变;ICI耐药样本#23存在β2M最初是杂合子丢失,耐药后出现β2M纯合子丢失(图3)。

 

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

图3 抗原处理和递呈途径相关基因组景观

考虑到#23患者β2M进行性丢失强有力的遗传学证据以及β2M在HLA-I类抗原处理和呈递中的作用,作者进一步研究该病例:

 

#23,75岁女性,肺鳞癌IV期,卡铂和吉西他滨一线治疗,多西他赛二线治疗后进展,继而使用PD-L1抗体联合CTLA4拮抗剂抗体治疗,患者临床症状改善、病灶消退,4个月后发现新的腹腔肿块切除后继续进一年免疫治疗无明显进展,而她无在系统治疗9个月后复发,重新开始抗PD-L1和抗CTLA4治疗,影像学提示有明显的二次应答。病理切片结果提示ICI治疗前肿瘤标本病理显示肿瘤细胞上PD-L1无明显的表达,ICI耐药后腹腔肿块标本显示肿瘤累及淋巴结,周围免疫细胞中PD-L1的表达增加,PCR实验β2M基因拷贝数变异分析显示,ICI耐药性样本中存在纯合子β2M丢失,免疫荧光结果同样证实了这一现象(图4)。

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

图4 免疫治疗获得性耐药#23患者β2M基因缺失。A.影像学变化及治疗之间轴;B/C.耐药前后肿瘤组织病理切片;D.荧光定量PCR β2M基因拷贝数变化;E.和F. 免疫荧光耐药前后肿瘤组织内β2M蛋白定性及定量分析 

接下来作者研究了3个来源于ICIs具有耐药性的肿瘤样本的PDX(#8、#23和#26)以及另外两个对免疫检查点抑制剂原发性耐药(#3、#7)样本,观察ICIs产生不同耐药情况下肿瘤PDX样本中观察到β2M蛋白水平较低。由于β2微球蛋白是HLA-I类分子的重要组成部分,流式结果证实HLA-I类分子的数量与β2M呈正相关(图5)。

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

图5 β2M基因缺失后ICI耐药性肿瘤中HLA-I类抗原加工和呈递的缺陷。A. Western blot分析#23没有β2M蛋白表达,β2M蛋白在其他肿瘤患者PDX中有表达(# 26, 3, 7, 和8);B. 流式细胞术分析结果与A吻合;C. HLA-I类分子与β2M数量呈正相关

3.β2微球蛋白在免疫检查点抑制剂耐药中的作用

 

为进一步明确β2M在介导免疫检查点抑制耐药中的作用,作者采用CRISPR技术敲除小鼠肺癌细胞中的β2M,将β2M野生型/β2M基因敲除的细胞注射到相同免疫活性A/J小鼠右腿,当肿瘤体积达到约30mm3时,小鼠被随机注射抗PD-1或同型对照抗体,结果发现具有完整β2M的小鼠对PD-1抗体有应答,而β2M基因敲除组PD-1抗体治疗后无效。(图6)。

 

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

图6 β2M表达缺失会导致PD-1抑制剂治疗耐药。Western blot分析β2M敲除的小鼠肺癌细胞;B.比较抗PD-1治疗的β2M野生型和β2M敲除株系在小鼠体内同一时间点瘤体体积

 

 

讨论

 

 

大约20%的晚期NSCLC患者对PD-1或PD-L1抑制剂能够应答,但是许多患者会产生耐药,目前对肺癌产生的这种耐药性的机制了解有限。通过对PD-1抑制剂产生耐药性的NSCLC患者的系列肿瘤标本进行分析,Katerina团队发现一例对联合抗PD-L1和抗CTLA-4治疗的患者获得性耐药的肿瘤组织样本中的纯合子β2M缺失,β2M是HLA-I类复合物的重要组成部分,肿瘤β2M缺陷与免疫逃逸有关。该研究首次报道HLA-I类抗原处理受损作为NSCLC患者对ICIs获得性耐药性的机制。总之,这项研究证明抗原处理缺陷可能成为肺癌对ICIs产生获得性耐药的机制之一,研究这些缺陷发生的频率和导致这些缺陷的潜在机制对于理解和克服免疫疗法的耐药性具有重要意义。

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摘要

 

 

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

目前,我们对获得性免疫检查点抑制剂(ICI)耐药的机制知之甚少。有文献报道,黑色素瘤PD-1抑制剂治疗中获得性耐药机制与肿瘤细胞非同义突变减少、β2微球蛋白缺失/突变介导的HLA I类分子抗原处理缺陷以及JAK1/2失活突变介导肿瘤细胞干扰素(IFN)信号缺陷相关。但肺癌免疫检查点抑制剂耐药机制不明,基于此,Katerina Politi团队入组14例患者,通过研究HLA-I类抗原处理和提呈机制(APM)组件的基因改变来判断是否对PD-1PD-L1抗体获得性耐药。结果表明,HLA-I类分子抗原提呈机制的破坏可导致肺癌免疫检测抑制剂耐药。
 
1.免疫检查点抑制剂肿瘤耐药的基因表达情况
为了确定与获得性ICI耐药相关的细胞和分子机制,Katerina Politi团队系统地分析了2011至2016年间在机构内治疗ICI耐药的非小细胞肺癌NSCLC)患者,入组14例,在使用PD-1治疗前及产生耐药时采集可用的肿瘤样本进行了全外显子组DNA测序(图1)。
 

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图1 获得性耐药ICIs病例分析过程特点。A.14例入组患者重复活检及样本分析示意图;B.不同患者的免疫治疗方案;C.单个病人对免疫治疗的应答时间,对ICIs的耐药和治疗时间点
 

作者研究了肿瘤样本体细胞非同义(NS)突变的数量ICI耐药前后是否发生变化,结果发现在ICI获得性耐药8个病例中有6例标本NS突变负荷增加。为了评估ICI耐药样本中肿瘤新抗原可能发生改变,他们通过相关软件预测肿瘤样本了肿瘤新抗原的HLA限制性的数量,发现候选肿瘤新抗原的数量与体细胞突变的数量普遍相关,8个获得性耐药病例中有6例增加(图2)。

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

图2 患者样本ICIs获得性耐药的突变景观。A.体细胞突变负荷;B.肿瘤新抗原负荷

2.ICIs耐药时β2M微球蛋白缺失

黑色素瘤结直肠癌派姆单抗耐药的病例中发现HLA-I类抗原的处理和提呈存在缺陷。为确定患者样本队列中是否存在编码HLA-Ⅰ类分子APM机制的基因遗传缺陷,作者调查了72个与抗原处理和提呈相关基因(http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?hsa04612)。基因拷贝数变异分析显示,ICI耐药样本中具有获得性突变的基因:PSMD13、CD207、PSMD4、PSMD7和PSMD1,但未发现这一途径中基因的反复突变和/或拷贝数改变;ICI耐药样本#23存在β2M最初是杂合子丢失,耐药后出现β2M纯合子丢失(图3)。

 

HLA-I分子加工和递呈抗原功能受损是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因

图3 抗原处理和递呈途径相关基因组景观

考虑到#23患者β2M进行性丢失强有力的遗传学证据以及β2M在HLA-I类抗原处理和呈递中的作用,作者进一步研究该病例:

 

#23,75岁女性,肺鳞癌IV期,卡铂和吉西他滨一线治疗,多西他赛二线治疗后进展,继而使用PD-L1抗体联合CTLA4拮抗剂抗体治疗,患者临床症状改善、病灶消退,4个月后发现新的腹腔肿块切除后继续进一年免疫治疗无明显进展,而她无在系统治疗9个月后复发,重新开始抗PD-L1和抗CTLA4治疗,影像学提示有明显的二次应答。病理切片结果提示ICI治疗前肿瘤标本病理显示肿瘤细胞上PD-L1无明显的表达,ICI耐药后腹腔肿块标本显示肿瘤累及淋巴结,周围免疫细胞中PD-L1的表达增加,PCR实验β2M基因拷贝数变异分析显示,ICI耐药性样本中存在纯合子β2M丢失,免疫荧光结果同样证实了这一现象(图4)。

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图4 免疫治疗获得性耐药#23患者β2M基因缺失。A.影像学变化及治疗之间轴;B/C.耐药前后肿瘤组织病理切片;D.荧光定量PCR β2M基因拷贝数变化;E.和F. 免疫荧光耐药前后肿瘤组织内β2M蛋白定性及定量分析 

接下来作者研究了3个来源于ICIs具有耐药性的肿瘤样本的PDX(#8、#23和#26)以及另外两个对免疫检查点抑制剂原发性耐药(#3、#7)样本,观察ICIs产生不同耐药情况下肿瘤PDX样本中观察到β2M蛋白水平较低。由于β2微球蛋白是HLA-I类分子的重要组成部分,流式结果证实HLA-I类分子的数量与β2M呈正相关(图5)。

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图5 β2M基因缺失后ICI耐药性肿瘤中HLA-I类抗原加工和呈递的缺陷。A. Western blot分析#23没有β2M蛋白表达,β2M蛋白在其他肿瘤患者PDX中有表达(# 26, 3, 7, 和8);B. 流式细胞术分析结果与A吻合;C. HLA-I类分子与β2M数量呈正相关

3.β2微球蛋白在免疫检查点抑制剂耐药中的作用

 

为进一步明确β2M在介导免疫检查点抑制耐药中的作用,作者采用CRISPR技术敲除小鼠肺癌细胞中的β2M,将β2M野生型/β2M基因敲除的细胞注射到相同免疫活性A/J小鼠右腿,当肿瘤体积达到约30mm3时,小鼠被随机注射抗PD-1或同型对照抗体,结果发现具有完整β2M的小鼠对PD-1抗体有应答,而β2M基因敲除组PD-1抗体治疗后无效。(图6)。

 

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图6 β2M表达缺失会导致PD-1抑制剂治疗耐药。Western blot分析β2M敲除的小鼠肺癌细胞;B.比较抗PD-1治疗的β2M野生型和β2M敲除株系在小鼠体内同一时间点瘤体体积

 

 

讨论

 

 

大约20%的晚期NSCLC患者对PD-1或PD-L1抑制剂能够应答,但是许多患者会产生耐药,目前对肺癌产生的这种耐药性的机制了解有限。通过对PD-1抑制剂产生耐药性的NSCLC患者的系列肿瘤标本进行分析,Katerina团队发现一例对联合抗PD-L1和抗CTLA-4治疗的患者获得性耐药的肿瘤组织样本中的纯合子β2M缺失,β2M是HLA-I类复合物的重要组成部分,肿瘤β2M缺陷与免疫逃逸有关。该研究首次报道HLA-I类抗原处理受损作为NSCLC患者对ICIs获得性耐药性的机制。总之,这项研究证明抗原处理缺陷可能成为肺癌对ICIs产生获得性耐药的机制之一,研究这些缺陷发生的频率和导致这些缺陷的潜在机制对于理解和克服免疫疗法的耐药性具有重要意义。

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