紫薯博士专栏 | 重磅突破！靶向RAS小分子药物最新进展

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RAS信号通路简介

大鼠肉瘤Ratsarcoma（RAS）致癌基因由三个成员（KRAS、HRAS和NRAS）组成，属于小GTP酶家族，其中KRAS又分为KRAS4a、KRAS4b两个亚型。在正常发育或生理条件下，RAS接收生长因子和各种其它细胞外信号而被激活，负责调节细胞生长、存活、迁移和分化等功能。

RAS蛋白的开/关状态通过核苷酸结合确定，活性信号传导构象结合GTP，非活性构象结合GDP。

RAS蛋白中的错义突变通过减少GTP水解（G12，Q61），或通过增加GTP加载速率（G13，K117），或核苷酸交换（A146）而改变GDP和GTP稳态平衡，从而持续激活信号通路。RAS突变在人类癌症中平均占25%，为所有致癌基因突变中最高的。全球每年有100万人因KRAS突变死于癌症。

RAS通路

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以粉红色突出显示的基因经常在人类癌症中被删除。绿色显示的基因经常被突变激活。

在RAS家族成员中，致癌突变最常见于KRAS（85％），而NRAS（12％）和HRAS（3％）则较为少见。大多数RAS家族突变发生在氨基酸残基12、13和61处，在3维空间构象中，这些氨基酸残基多与GTP有直接相互作用。比如，氨基酸残基12处的甘氨酸突变为除脯氨酸以外的任何其它氨基酸均会产生空间阻断，阻止GAP蛋白进入KRAS，从而抑制GTP水解并导致高活性的GTP结合形式的KRAS显著增加。

四种人RAS蛋白的示意图

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KRAS突变在美国三大致命癌症类型中普遍存在：胰腺癌（95％）、结肠直肠癌（45％）和肺癌（25％），而在乳腺癌、卵巢癌和脑癌中很少发现（<2％）。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，KRASG12C是最常见的突变，占所有KRAS突变的近一半，其次是G12V和G12D。在非小细胞肺癌中，特定等位基因突变频率的增加多来自经典的由吸烟诱导的典型突变（G:C至T:A置换），从而导致了KRASG12C（GGT至TGT）和G12V（GGT至GTT）突变。

大型基因组学研究表明，肺癌KRAS突变，包括G12C，与NSCLC中其它已知的驱动致癌突变相互排斥，包括EGFR、ALK、ROS1、RET和BRAF，表明KRAS突变在肺癌中的独特性。而同时，KRAS突变经常与某些共突变共同发生，例如STK11、KEAP1和TP53，它们与突变的RAS合作将细胞转化为高度恶性和侵袭性的肿瘤细胞。

KRAS是胰腺癌、结肠直肠癌和肺癌突变的主要同类型。NRAS是皮肤黑色素瘤和急性髓性白血病中突变的主要同类型，而HRAS是膀胱和头颈部鳞状细胞癌中突变的主要同类型。至于为什么KRAS总体上突变率最高，为什么特定RAS基因在特定癌症中优先突变，这些问题仍旧有待进一步研究。

人类癌症中的KRAS突变

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靶向RAS的不同策略

三种RAS癌基因构成了人类癌症中突变最频繁的基因家族。令人失望的是，尽管经过三十多年的研究努力，临床上仍然没有有效的抗RAS疗法，这不禁令人将RAS归于“不可靶向”（undruggable）的靶点。

RAS药物发现的历史中充满了错误、失误和误解。正如中国古代军事战略家孙子在“战争艺术”中所写的那样，知己知彼，方能百战不殆。2013年美国国家癌症研究所宣布成立RAS研究中心，开始了新一轮靶向RAS的抗争（NCIRASInitiative,CancerResearchTechnologyProgram）。

靶向RAS的总体策略可以归纳为5类：

首先为直接结合RAS蛋白，破坏其与GTP交换因子或与效应物如RAF丝氨酸-苏氨酸激酶的相互作用。
其它四种间接方法：

（i）调节RAS与质膜结合的蛋白酶（例如，法尼基转移酶和PDEδ）；

（ii）抑制RAS效应子信号传导（例如，RAF和PI3K）；

（iii）靶向突变RAS的合成致死相互作用物；

（iv）干扰RAS调节的癌细胞代谢过程。

抗RAS药物开发的五个通用策略

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直接靶向RAS的策略首先遇到了强烈挑战，特别是来自药物化学合成上的挑战：RAS缺乏足够大的能够结合小分子的口袋；与蛋白激酶与ATP的亲和力较弱不同，RASGTP酶对GTP的亲和力高达皮摩尔，结合力是激酶与ATP的百万倍；而细胞内高浓度的GTP（>500μM）的存在以及致癌RAS水解GTP的能力受损进一步增加了药物设计上的难度。

早期直接靶向RAS尝试的失败及靶向RAS口袋的缺乏使得RAS成为最有名的“不可靶向“靶点。而靶向RAS信号通路的努力更多集中在间接手段上。

然而，间接靶向KRAS的策略也是困难重重，包括阻断KRAS细胞膜定位和靶向KRAS下游的信号分子，如RAF、MEK、ERK和PI3K等家族成员。具体而言，间接途径的困难包括：（1）RAS是正常细胞生长和存活相关的必需途径，靶向必需途径首先面临严重的毒副作用，导致疗效指数非常狭窄甚至没有；（2）补偿逃逸机制，以及（3）由于严格调节导致的信号反馈和冗余。

靶向RAS质膜定位

RAS最初被合成为存在于胞质的无活性蛋白质。RASC-末端CAAX（C，半胱氨酸;A，脂肪族氨基酸;X，末端氨基酸）四肽基序为一系列翻译后修饰提供信号。首先是法尼基转移酶（FT）催化的法尼基部分与CAAX序列的半胱氨酸残基的共价加成。第二个发生在内质网的胞质表面，是通过RAS转化酶1（RCE1）蛋白水解去除最后三个氨基酸。最后，异戊二烯半胱氨酸羧基甲基转移酶（ICMT）促进甲基转移至C-末端氨基酸以消除负电荷并防止质膜排斥。CAAX信号的修饰，加上棕榈酸脂肪酸（HRAS、KRAS4A和NRAS）和/或聚赖氨酸序列（KRAS4A和KRAS4B），促进RAS结合到质膜。RAS结合于质膜的内表面对其功能发挥至关重要。结合于质膜的RAS活性高于胞质中RAS的百倍。

鉴于法尼基脂质修饰对RAS致癌活性的重要作用，制药公司于1990年开始对FTI进行大量研究。

幸运的是，FT选择性抑制剂(FTI)比较容易得到，而FTI的体外研究表明，其在各种癌症小鼠模型中可有效阻断HRAS驱动的癌细胞生长。两种抑制剂（lonafarnib和tipifarnib）进入III期临床试验，并在具有KRAS突变（胰腺癌、结肠直肠癌和肺癌）的癌症中进行了测试，但不幸的是所有FTI在具有高频KRAS突变的肿瘤中没有活性。后续的研究发现，第一个误解即最初认为HRAS功能突变等同于KRAS，而实际上二者差异很大。KRAS突变导致大部分肿瘤发生，而不是HRAS。TKI可以有效抑制HRAS的质膜结合，但对于KRAS，存在替代的质膜结合途径（香叶基香叶基类异戊二烯），所以无效。这一失败使得制药界对靶向RAS的信心与热情大减。

不过，FTI在HRAS突变的患者人群好像疗效还不错。Kura买断tipifarnib的权益，重新筛选HRAS突变的患者，初步临床数据非常积极。

最近几年，靶向KRAS的质膜结合重新进入人们的视野。一种方法是通过功能筛选发现小分子fendiline可以抑制一种L型钙通道，进而阻断KRAS4B但不是HRAS或NRAS的质膜结合。Fendiline通过非特异性地抑制酸性鞘磷脂酶起作用，导致质膜磷脂酰丝氨酸水平降低。

另一个进展是发现了异戊二烯结合蛋白磷酸二酯酶δ（PDEδ）。PDEδ是促进RAS蛋白转运至高尔基体或再循环内体的增溶因子，并且从那里，RAS通过定向囊泡转运至质膜。具有不同的化学骨架的两个小分子deltarasin和deltazinone，可以占据PDEδ的法尼基结合口袋。当这些小分子抑制PDEδ时，发现RAS从质膜转移到内膜，从而减少了RAS的致癌信号，在体外的异种移植模型中减少了RAS突变癌细胞的致瘤性生长。

原则上，靶向PDEδ将克服上面FTI遇到的问题。然而，由于PDEδ也调节其它法尼基化蛋白质的功能，PDEδ的抑制剂可能受到脱靶RAS非依赖性活性的毒性影响。疗效窗口够不够，还需要进一步的临床验证。

靶向RAS下游效应信号传导

阻断下游效应子信号传导是靶向RAS最具吸引力的策略之一。然而，对于至少11种不同的下游效应信号途径，关键问题是应该靶向哪种效应子以及是否需要同时抑制多种效应子。引起最大关注的两种效应途径是RAF-MEK-ERK促分裂蛋白激酶（MAPK）信号途径和PI3K-AKT-mTOR途径。已知编码这两种途径的组分（BRAF和PIK3CA）的基因中的突变是重要的驱动致癌因素，而它们本身的也是可靶向的蛋白激酶。但BRAF与PIK2CA的突变与RAS的突变很多时候并不重合，它们是相对独立的下游驱动致癌因素。通过筛选生物标记物靶向BRAF或PIK2CA也没有参考RAS的突变状况，所以，严格来讲，靶向BRAF与PIK2CA并不属于靶向RAS突变的主要手段。

已经批准的第一代RAF抑制剂（vemurafenib和dabrafenib）用于治疗BRAF突变黑色素瘤。然而，当在RAS突变癌细胞中评估这些抑制剂时，观察到ERK信号传导的反常激活而非抑制。后来发现第一代RAF抑制剂仅抑制BRAF，不但不抑制CRAF，反而引起CRAF的活性提高，从而激活了MEK-ERK信号通路。新一代的RAF抑制剂包括LY3009120和PLX8394，是广谱型的RAF抑制剂，临床试验正在进行中。

两种MEK1和2的高选择性抑制剂（trametinib和cobimetinib）在临床上也获得批准用于治疗BRAF突变黑色素瘤。然而，这些抑制剂在RAS突变癌症中仅表现出有限的功效，部分原因是由于缺乏ERK介导的反馈抑制机制。

PI3K-AKT-mTOR途径在RAS依赖性肿瘤生长中可能起较小作用。虽然它与RAF-MEK-ERK信号通路有互补作用，但它们的联用在临床上并没有看到增益效应，也许是毒性限制了它们的有效剂量使用。

对于靶向RAS合成致死策略，及代谢途径，多限于概念验证阶段，离成药还较远。

最近召开的AACR意外报道了直接靶向KRAS的重大进展。

直接靶向KRAS的重大突破

RAS蛋白作为分子开关起作用，可以存在两种状态：GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态。

KRASG12C突变在非小细胞肺癌中占据14%，在结直肠癌中约5%，胰腺癌中1%，是设计半胱氨酸共价结合药物潜在的理想靶点。2013年Shokat及其同事在一篇突破性《Nature》文章中报道了靶向KRASG12C突变的可能性，其中他们筛选设计的活性小分子能够在G12C处不可逆地与突变体半胱氨酸结合到KRAS效应区附近的一个小口袋。结合到这个口袋的小分子可以通过将蛋白质锁定在GDP结合的非活性状态来抑制KRAS活性。

KRAS G12C直接靶向不可逆的小分子

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WellspringBiosciences是一家由强生资助的小型生物技术公司。它们多年来专注于KRASG12C共价抑制剂的改进研发，是直接靶向KRAS的拓荒者。

2016年，Wellspring在《癌症发现》上报道了靶向KRASG12C的小分子ARS-853。虽然活性仍在微摩尔级，但完成了细胞及动物试验的概念验证。同时表明KRASG12C结合的核苷酸处于动态平衡状态，而靶向低活性的GDP结合形式是可行有效的方法。

Wellspring在2018发表在《细胞》上的文章报道了新一代的KRAS小分子抑制剂ARS-1620。活性提高到几百纳摩尔级，并进一步在细胞及动物模型上验证了靶向KRASG12C的可行性。

在最近召开的AACR年会上，Amgen和Mirati分别报道了其靶向KRASG12C的小分子，已经开始了一期人体临床试验。

Amgen的AMG510：Amgen的研究人员筛选了663个丙烯酰胺小化合物库，发现了一种与KRASG12C结合较弱的先导丙烯酰胺化合物。晶体学数据显示它位于KRAS的一个浅口袋中。与CarmotTherapeutics公司合作，Amgen团队筛选了更多的潜在抑制剂，并再次发现许多小分子可以以不

同的方式结合在这个口袋中。当与其中的一些小分子结合时，晶体学数据显示组氨酸残基可以翻转以显示隐藏的凹槽。研究小组进一步研究了结合突变体的化合物，他们发现表现最好小分子可以通过翻出组氨酸来进一步结合到凹槽内部。该分子的甲基、异丙基取代的吡啶环卡在两种构象中的一种，使得AMG510成为阻转异构体（atropisomer）。Amgen在AACR上披露了其进入临床的小分子结构和其与KRAS结合的共晶结构。同时，细胞及动物试验验证了AMG510的活性及高选择性。AMG510于2018年8月27日正式开始临床试验，是第一个进入临床的直接靶向KRAS的小分子抑制剂。

KRAS G12C bound to GDP (left) and AMG 510 (right)

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黄色区域是AMG510共价连接半胱氨酸的地方。粉红色地区显示候选药物将组氨酸排出

来自圣迭戈的创新生物科技公司Mirati则公布了其KRAS的临床小分子MRTX849的类似物MRTX1257：Mirati与药化实力强劲的Arrays于2014开始合作，设计开发KRASG12C共价结合抑制剂（Arrays曾为LOXO贡献了高质量的TRK抑制剂larotrecitnib和RET抑制剂LOXO-292）。Arrays通过基于结构的强化药物设计，分析了150多种独特的KRAS与小分子结合的共晶结构，并合成和评估了约2000个不同小分子。临床候选小分子MRTX849是靶向KRASG12C的有效和可口服的小分子抑制剂，在2018年第4季度完成IND，于2019年1月15日正式开始一期临床研究。资本市场非常慷慨地给予了MRTX849约20亿美元的预期公司市值。

Mirati在AACR上没有公布MRTX849的结构，而是报道了结构类似的化合物MRTX1257的结构及细胞与动物活性。MRTX1257表现出出色的细胞活性，EC50达到几十纳摩，在3D培养的条件下

活性甚至更高。与KRAS野生型相比，KRASG12C的癌细胞有高达>1000倍的选择性。这也许是将来靶向KRASG12C共价小分子成功的关键。

Mirati的墙报中还报道了其MRTX1257在多达26个不同细胞或PDX肿瘤模型中的抗肿瘤活性瀑布分布图，总体效果非常不错。对部分应答不佳的模型，通过基因组测序分析也能够找到旁路耐药机制。

Amgen和Mirati均报道了多种潜在的组合疗法，看来将来重点开发方向应该是联用。

小结

RAS基因具有作为人类癌症中鉴定的第一个突变基因的独特荣誉，开创了分子靶向抗癌药物发现的新时代。同时，RAS突变也是所有致癌基因突变比例最高的，高达25%。

然而，随着对RAS的生物功能复杂性的更多认识，直接靶向RAS的努力并没有及时转化成回报。KRASG12C的突变给不可逆共价小分子的药物设计打开了一扇窗口。Wellspring是靶向KRASG12C的先锋，对靶向KRASG12C的概念验证做出了巨大贡献。而Amgen与Mirati则捷足先登，率先找到足够活性和理化特性的候选化合物，进入临床。

接下来，对于看到靶向KRASG12C小分子的临床单药疗效非常有信心。但能否击败标准疗法、化疗，特别是化疗与PD-1的联用，则是关注的焦点。毕竟在非小细胞肺癌KRAS突变人群，免疫疗法应答是最好的。

如果靶向KRASG12C临床获得成功，那么靶向在胰腺癌中占比超过40%的KRASG12D，也许会成为下一个有待攻克的桥头堡？当然，难度要高很多，很多。

References:

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