万字好文分享:靶向蛋白降解药物(TPD),一个全新的小分子药物时代即将来临!(下)

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作者简述        

本文是呈益投研对TPD领域历史沿革的梳理,作为呈益投资决策的参考之一。本文共3万多字,将分上下两部分在药时代宣传矩阵上独家首发。第一部分主要是UPS系统和相关药物的发现历程;第二部分涉及分子胶类TPD药物的历史以及其他蛋白降解系统。参考文献会在第二篇文末统一列出。

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万字好文分享:靶向蛋白降解药物(TPD),一个全新的小分子药物时代即将来临!(上)

 

05
分子胶类的蛋白降解药物
沙利度胺和来那度胺为代表
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前面我们提到在UPS系统发现的过程中,一直研究蛋白降解酶的Hershko教授和研究染色体的VARSHAVSKY教授殊途同归,用不同的故事线都对UPS的发现和机制阐明做出了重要的贡献。无独有偶,在UPS相关的蛋白降解药物的研发中,除了PROTAC外,如果还要寻找一条故事线的话,新基的沙利度胺及其衍生物也发挥了重要的作用。沙利度胺的历史众所周知,从臭名昭著到救人无数,以及后续衍生物年销售额超过100亿美金的来那度胺,差别小到毫厘的两个分子命运的差别如此之大,必将引起全球科学家的关注。
前文提到James Bradner教授受到Hiroshi Handa启发来开发基于度胺类化合物的PROTAC,而Hiroshi Handa教授研究沙利度胺的兴趣也来自于他一直关注并对沙利度胺的生理作用产生的浓厚兴趣:度胺类(邻苯二甲酰亚胺)药物作用为何差别如此巨大。(除了孕吐的治疗,沙利度胺当时还被用于治疗肿瘤和麻风病)
沙利度胺绝对是制药史上最具有传奇色彩的药物,臭名昭著但却也救人无数,如此大的反差也不断吸引产业和院校学者几十年来持续对其进行研究,针对这类药物的机制研究对整个制药领域发展的贡献也十分巨大。直到今日,多个度胺类药物已经上市销售或进入临床后期阶段,同时多个进入临床阶段的PROTAC也是以度胺类结构作为与E3结合的配体,度胺类药物仍在继续着其传奇的经历。
沙利度胺(α-N-[phthalimido] glutarimide)的起源是一种镇静药巴比妥盐,巴比妥是上世纪50年代初一种广泛应用的镇静药物,但副作用较大。1952年瑞士一家制药公司Ciba合成了一种新的巴比妥类似化合物Glutethimide,号称其要比传统的巴比妥盐更安全。Glutethimide是度胺类药物的起源,而合成Glutethimide的公司Ciba是瑞士一家历史悠久的制药公司,现在鼎鼎大名的诺华制药就是Ciba几经重组而来。
Glutethimide的一个类似物Aminoglutethimide后来被用于癫痫的治疗,而Glutethimide的另一个类似物(α-N-[phthalimido] glutarimide)被德国一家公司Chemie Grunenthal开发,这就是大名鼎鼎(臭名昭著)的沙利度胺。巧合的是沙利度胺的主要开发者叫Heinrich Mueckter,他曾经在纳粹集中营工作,期间曾从事抗生素的研究,并利用战俘做人体试验,Heinrich Mueckter和他开发的沙利度胺同样的臭名昭著。后面的故事大家都知道,沙利度胺1956年上市销售,用于孕妇晨吐的治疗,1963年退市时已经不可挽回的造成了多达3000名畸形宝宝的出生。沙利度胺的化合物改造如下:

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虽然沙利度胺1963年最后退市,但在上市期间,很多临床医生发现沙利度胺对一些疾病有显著的疗效,加之其优异的药代特性,考虑到患者需求,因此很多医生仍在使用沙利度胺治疗某些难治的麻风病和肿瘤。1998年FDA批准沙利度胺用于麻风病并发症的治疗,2006年批准其用于多发性骨髓瘤的治疗,但由于其新生儿致畸的副作用,沙利度胺的使用受到严格的限制。2007年沙利度胺类似物来那度胺也被批准上市。
早在1992年,洛克菲勒大学的免疫学家Gilla Kaplan发现沙利度胺能够抑制血管的生成,这也是沙利度胺1998年获批治疗麻风病的理论基础。进入2000年后,科学家们陆续发现了沙利度胺、来那度胺等药物可以通过激活免疫细胞活性来杀伤肿瘤,这个很像PD-1,而后者2014年才上市。2000年起,度胺类药物更多的免疫学机制被揭示,直接观察对靶细胞的杀伤作用包括肌动蛋白聚合和重定位导致细胞骨架重组、细胞周期停滞等,通过自分泌抑制的膜蛋白细胞因子,抑制肿瘤致瘤基因,如IRF4 和 C-MYC并同时诱导肿瘤抑制基因的激活。
而在针对MM的研究中,研究者通过模拟多发性骨髓瘤的肿瘤微环境发现来那度胺通过诱导激活caspase6产生细胞凋亡从而发挥其细胞毒作用,此外肿瘤微环境中来那度胺可恢复细胞突触的形成(这在血液瘤患者中通常是有缺陷的)从而增强自然杀伤细胞的细胞毒性等。以上机制充分说明来那度胺主要通过激活患者自身的免疫系统来发挥作用,其机制非常类似现在流行的免疫疗法,也难怪来那度胺的销售额超过100亿美金,是销售额上是唯一能和PD-1匹敌的小分子抗肿瘤药物。这也是为什么新基的几个度胺类药物被称为”IMiDs”(Immunomodulatory imide drugs)的原因,即具有免疫调节功能的亚胺类药物。
但沙利度胺结合了什么靶蛋白,人们仍不清楚。2010年,日本科学家Hiroshi Handa首先发现沙利度胺在细胞可以结合Cereblon,一种E3泛素连接酶的重要组成部分,从而导致其致畸性。度胺类药物和UPS系统开始相交。
在当时,药物结合靶点主的研究要依赖亲和层析,但效率较低。2009年,东京工业大学的Hiroshi Handa团队开发了一种亲和力乳胶珠子和磁珠筛选系统可以高通量的用于现有药物的靶点蛋白的确认和纯化。紧接着在2010年,Handa团队就将这套高通量筛选系统用于沙利度胺的靶点确认,他们很快就发现了沙利度胺直接结合蛋白是cereblon,同时发现DDB1蛋白通过cereblon间接与沙利度胺相结合,从而形成DDB1-cerelon-沙利度胺复合物。而早在2006年,科学家们就发现DDB1-CUL4-ROC1 复合物是一类E3连接酶复合物,现在Handa团队发现cerblon也是这个复合物的重要成员,这样这类E3连接酶复合物的成员基本搞清楚了,Handa团队找到了最重要的一张拼图,CRBN、DDB1和 Cul4A的组合形成了完整的E3,同时证明正是沙利度胺和CRBN、DDB1、 Cul4A复合物的结合导致了其致畸的副作用。但E3复合物的功能主要是通过降解目标蛋白来实现,应该是度胺类化合物通过PPI形成的E3降解了某个蛋白,有了Handa教授的研究的基础,最终的答案的揭晓也只是时间的问题。
在cereblon作为IMIDs的靶点被发现后,大家对cereblon的关注开始增加,2013年,英国血液学杂志和Blood杂志分别发表了一篇文章,描述了用来那度胺治疗病人的生存和预后与cereblon的表达正相关。考虑到cereblon是CRBN-DDB1-CUL4 E3复合物的重要成员,IMiDs主要功能是促进E3复合物形成从而发挥其降解功能,并且cereblon含量越高,其降解作用越好,科学家们开始寻找被IMiDs降解的蛋白。
有了前面的基础,一切都变得顺理成章,就像Handa教授用沙利度胺钓到了cereblon,这次的鱼饵就是来那度胺了,来自哈佛和MIT共建的Broad研究所和Dana-Farber研究所的科学家同时在SCIENC EXPRESS上发表文章,非常有意思的是这两篇文章在同一期相邻发表,如下图:17 JAN 2014 301-305和17 JAN 2014 305-309,在文章中科学家都使用“钓鱼”的方式来寻找被那度胺降解的蛋白,两个团队都发现来那度胺可通过cereblon降解IKZF1/3,后者正是抑制T细胞分泌IL-2的关键蛋白。所不同的是两个团队用的钓蛋白的方式不同,Dana-Farber研究院用多达15000多个ORF的质粒库结合发光蛋白来找到IKZF1, 而BROAD研究所则是基于固定来那度胺+同位素标记+定量质谱来找到IKZF1, 同时还进一步验证了Handa教授2010年提出的沙利度胺和cereblon结合的机制,BROAD研究所同时指出来那度胺也可以通过结合DDB1和CRBN与CUL4、ROC1一起组成新的E3泛素连接酶(CRL4)。如下图:

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两篇同期在science发表的文章,图片来源:Sciencexpress 官网
紧随其后,来自哈佛的结构生物学家开始解析沙利度胺和CRBN以及DDB1的三维结构,文章半年后发表在Nature上,这为一些IMid小分子药物的设计带来了新的思路。同时人们也意识到IMiDs其实也是一类分子胶药物,通过拉进两种蛋白,使其发生PPI(蛋白蛋白相互作用)从而产生生理功能。
这里额外补充一些“分子胶”的研究历史,早在1992年,Stuart L. Schreiber教授就提出了分子胶(mulecular glue)的概念,Schreiber教授在药物化学领域鼎鼎大名,他是Broad研究所的创始人之一、化学生物学的开创者,他最早是一名化学合成领域的专家。
Schreiber教授在有机合成领域声名显著,当时合成化学里最时髦的领域如用光环加成构建立体化学、氢过氧化物裂解构建大环内酯化合物、双向合成等工具,Schreiber教授都是信手拈来。可以看出Schreiber教授早期醉心于天然分子的人工合成,并且成就斐然,如talaromycin B、 gloeosporone、hikizimicin, mycoticin A, epoxydictymene以及免疫抑制剂FK-506.
下图是epoxydictymene、FK-506等复杂大分子结构,可以感受下Schreiber教授当时合成这些分子所面临的难度。

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最早具有分子胶功能的药物是上世纪80年代初上市的环孢素,而当时的药物化学家热衷于在土壤中寻找抗真菌的抗生素,但却意外发现了具有免疫抑制作用的环孢素,后来瑞士的Sandoz制药将其开发用于治疗器官移植引起的排斥反应。这个药引入国内较早,国内很多医生也将其用于各种怀疑是自免引起的疾病,如疑似自身免疫系统引起的血小板降低等。
环孢素获批的当年,日本的科学家也在微生物中发掘具有更强免疫抑制作用的药物,这就是他克莫司(FK506),对环孢素和FK506的作用机制进一步进行研究揭示了他们非同寻常的作用机理:他们可以促进不同的蛋白发生相互作用,就像一种分子胶水一样,因此将这类药物称为“分子胶”。
如前所述,不只是Schreiber教授,在上世纪90年代,药物化学家普遍热衷于首次合成复杂的天然化合物或复杂结构的小分子,类似一种炫技。而对于Schreiber教授来说,FK-506的人工合成就是其成名之作,在Schreiber教授合成大量的FK-506之后,对于FK-506对免疫系统的抑制作用也一直激励着他深挖其作用机理。
在当时,除了环孢素、FK506外,还有一个化合物rapamycin也具有免疫抑制作用,这三个天然的免疫抑制剂激发了很多的科学家对它们的作用机制进行研究。非常有意思,就像解方程式一样,围绕着这三个化合物的一些已知条件(已知的免疫抑制机制和作用底物),科学家们推导出其他未知的参数(未知的机制)并用实验进行证实。我们先来看已知的条件,如下:
1)CSA的直接底物是亲环蛋白、FK506的直接底物是FKBD、rapamycin的底物也是FKBD。
2)后续的研究却发现CsA和FK506的免疫抑制作用主要通过阻断钙依赖的信号传导途径(TCR受体来源),而rapamycin的免疫抑制作用主要通过阻断非钙离子的信号传导途径(IL-2受体来源)。
3)研究发现,包括亲环蛋白和FKBP都具有氨基酸顺反异构酶活性,这些与免疫抑制作用毫无关联。
通过以上条件我们可以先得出一些推论:首先具有免疫抑制的三种化合物作用于两种不同的底物,其次三种化合物与底物结合后也对应两种不同的信号通路。但这两种底物和两种信号通路之前却不能对应起来。这些推论使得Schreiber教授非常疑惑,常规的抑制剂理论已经不能解释以上的发现。
但就像一个三元函数,只有确认两个参数才能推导出最后的一个参数,而化合物和底物只是两个参数,Schreiber教授也认为还存在着第二种底物与这些化合物的免疫抑制活性直接相关。而化合物与底物的结合从而导致底物生物结构发生变化,要找出新的底物,必须综合考虑使用免疫抑制剂与底物结合后新的底物结构。后来的发现也是如此CsA-亲环蛋白的组合物以及FK506与FKBP的组合物都可与phosphatase calcineurin结合,而rapamycin-FKBP则不同,其结合底物可抑制mTOR通路。以上蛋白相互作用使用单体的FKBP和亲环蛋白都不具备,只有与各自对应的小分子结合后才能发挥新的功能。在这里小分子发挥了一种使得与其结合的蛋白获得新的生物学功能的作用。就像一种胶水使得两种蛋白相互结合从而形成新的功能蛋白复合体,分子胶的概念就此诞生了。
分子胶极大的扩充了之前小分子的成药范围,与传统的抑制剂不同,分子胶等功能分子不是简单的通过占住蛋白空间结构,而是通过改变蛋白形成新的构型来驱动蛋白产生新的功能来发挥其生理功能,即事件驱动。在正常的细胞内,天然的事件驱动机制无处不在,如染色体的甲基化、乙酰化、细胞质层面的泛素化、信号转导、TCR与抗原结合等免疫反应,调控着人体的各项生理功能。蛋白质内氨基酸链微小的变化就可引起其界面的变化,从而获得或失去某些生理功能,这也是小分子调节蛋白的理论所在。Broad研究所的Schreiber教授、以及耶鲁的Crews教授都是这方面的专家,Schreiber教授更是因此创立了Broad研究所,以及Crews教授在耶鲁的主攻领域一直是小分子调节细胞功能等,这都与分子胶密切相关。广义的分子胶的理论和应用暂且放置一边,这又是一个巨大的话题,也是科学界一直关注的焦点。随着蛋白降解理论的兴起,分子胶在蛋白降解药物近年来受到了极大的关注。事实上,很难把分子胶和双功能分子分开,他们之间唯一的区别就是分子量的大小。Schreiber也曾经在FK506的基础上设计了最早的双功能分子FK1012,后者也被证明能够使得功能蛋白接近(proximity)从而发生生理功能。而在蛋白降解领域,分子胶和PROTAC也难从机制上区分开来,现在很多实验都发现PROTAC也具有分子胶的功能。事实上,PROTAC的两端分别结合靶蛋白和E3接近从而引起PPI,从而诱导UPS系统参与到后续的靶蛋白降解反应,而分子胶没有linker,可以同时结合靶蛋白和E3,人们只是习惯把分子量较小的蛋白降解剂称为分子胶。
2014年来那度胺等度胺类药物较为全面的作用机制的阐明给分子胶带来了空前的热度,在当时来那度胺已经是销售额近50亿美金的重磅炸弹,2019年其销售额更是超过了100亿美金,2020年,其销售额更是超过120亿美金,仅次于K药,位居全球畅销肿瘤药物TOP10第二名,多次盘踞榜单前三。科学家此时才发现拥有TPD功能的分子胶原来多年前就已上市销售,这种感觉非常奇妙,多年来药学界一直在追寻新一代的小分子化学药物,蓦然回首,原来这种药物已经上市多年,其独特的作用机制远比现有的激酶抑制剂等更加吸引人,它在临床应用的潜力是如此的巨大,这从来那度胺等的销售额就可初见端倪。
来那度胺的作用机制来自于其分子胶作用导致的免疫抑制解除,这与PD-1等作用机制可谓不谋而合,对于TPD药物来说,将致病蛋白完全降解或在蛋白水平改变转录因子、细胞周期蛋白的致病功能无疑拥有着无限的临床潜力。2015年,Ray Deshaies曾说过这一领域的淘金热已经开始,关于这一领域的文献几乎每年都已翻倍的速度在增加。
在这个快速增长的领域,科学的进展日新月异,用分子胶的概念来驱动细胞生理反应的机制研究不断涌现,耶鲁大学化学系的David Spiegel做了很多小分子调节生理功能的研究,如用小分子来调节免疫系统,用小分子平台MoDE-As来使用溶酶体降解胞外蛋白等。斯坦福化学和生物系的Wandless教授用小分子来调节蛋白的稳定性。UCSF药物化学系的Michelle Arkin教授是小分子发现中心的主任,他利用化学药物库来筛选作用于PPI的分子。MIT的Angela Koehler早年是生物化学和分子生物学背景,最初研究tRNA和DNA结合蛋白结构,后来在哈佛大学获得化学博士后,他早年师从Stuart Schreiber教授,后来在MIT专注于作用于PPI的小分子,尤其是针对转录因子的小分子。杜克大学Pei Zhou之前一直在化学系,他用结构生物学的方法来发现新的小分子,主要是NMR,Pei Zhou通过改变蛋白质的亚基来发现新的功能性小分子化合物。
但更多的科学家把分子胶的应用研究放在了靶向蛋白降解(TPD)上,尤其是泛素-蛋白酶体系统(UPS),后者快速降解蛋白特性,较为可控的药代和组织特异性相关的E3等特征使得UPS系统相关药物在临床的应用的前景和成药的优势更加突出。如前我们所述、在TPD领域Bradner, Craig Crews, Ray Deshaies等众多科学家已有多年研究,其中ARVINAS、C4、Kymera、MonteRosa等多家专注于PROTAC和分子胶的蛋白降解药物的biotec已经上市,并且已有数十个包含PROTAC和分子胶的蛋白降解药物进入临床。

除了近些年不断涌现的biotec,在TPD领域,有一家大型制药企业在蛋白降解领域的积累不容忽视,那就是新基制药,新基在TPD领域已经深耕多年,虽然来那度胺上市后才最终揭示其降解机制,但新基的团队早在2000年左右就在蛋白降解领域有深厚的积累,前面我们说过2001年,Crews教授发表的第一篇有关PROTAC的文章中,新基的团队就参与其中,文章的作者之一Frank Mercurio就来自新基,同时也是2001年前后,新基的另一位科学家Weilin Xie则被派往泛素化介导的蛋白质降解理论发现者之一、诺贝尔奖获得者Dr. Avram Hershko的实验室工作,2001年,Mercurio博士和Xie博士共同发起成立了新基的蛋白降解药物发现平台(protein degradation drug discovery platform),随着新基的沙利度胺、来那度胺、泊马度胺等一系列以TPD为作用机制的药物上市,新基也拥有全球最大、质量最高的TPD药物分子库和评价筛选系统。事实上,全球第三个进入临床的PROTAC药物也来自新基,之前的两个则是Arvinas靶向ER和AR的PROTAC,可见新基在这一领域20多年的积累之深。而严格意义上进入临床阶段(含上市)且具有蛋白降解功能的分子胶药物有9个,新基就开发了其中的6个,另外3个,一个来自诺华、一个来自C4,一个则来自BioTheryX,而BioTheryX的创始人和CSO也和新基有着千丝万缕的联系,可见新基在这一领域的强大实力。

 

06
新基的一些故事
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新基制药(Celgene)成立于1986年,由原美国化工巨头塞拉尼斯公司(Celanese Corporation)剥离其原料药业务重组而来, David Stirling博士是新基的科学创始人,首任CSO。Stirling博士毕业于英国Warwick大学,生物化学博士学位,最早任职于塞拉尼斯的一个研究性的生物技术部门。随着新基的剥离而加入新基,作为其早期创始人和首席科学家。刚开始加入塞拉尼斯时,Stirling认为自己并不会待太久,但随着生物技术部门的成立,他可以和许多化学家以及工程师们一起工作,并作为一个相对独立的研究部门,Stirling认为比预期的更有趣,所以决定留在塞拉尼斯,一直待到了Celgene成立。
1991年新基的一位化学家Sol Barer从洛克菲勒大学的科学家那里听说了沙利度胺,当时洛克菲勒大学的Gilla Kaplan研究发现沙利度胺的抗炎和免疫调节作用主要通过抑制TNF-α的分泌来实现。而在当时,临床医生也偶然发现沙利度胺对麻风病人和艾滋病患者并发的口腔溃疡有较好的疗效,Gilla Kaplan教授在机制上对这种临床效果做出一定解释。有了相应的作用机制,新基就可以说服FDA的官员并将其推入临床试验,很快在1998年,FDA批准沙利度胺用于麻风结节性红斑(ENL)的治疗。
而沙利度胺用于肿瘤的治疗的作用机制源自上世纪70年代Judah Folkman博士的肿瘤血管增生学说的广泛传播,当时学界认为肿瘤增长主要依赖于肿瘤周围血管的增生,因此抗肿瘤周围血管增生的药物有抑制肿瘤的潜力。动物实验发现沙利度胺有抑制兔和小鼠的角膜血管增生的作用,从而推断其主要作用于血管内上皮生长因子和成纤维细胞生长因子。随后的临床试验进一步验证沙利度胺的抗肿瘤效果。在阿肯色大学医学部,骨髓瘤抑制中心的Barlogie教授领衔的临床实验中,沙利度胺对骨髓瘤患者的治疗获得了极大的成功,在针对末线无药可治的MM患者中,约三分之一的患者对沙利度胺有反应,沙利度胺成为当时治疗MM三十多年来的首个新药。
度胺类早期被称为IMiDs,主要是很多实验证明其免疫调节作用,这也是这类药物获批用于MM治疗的机制基础,后来随着机制研究的深入,发现这类药物通过结合Cereblon发挥作用,后又被称为CELMoDs。事实早期这类药物的临床和机制研究主要依赖沙利度胺在临床上观察到了效果,虽然沙利度胺遭遇退市,但其上市期间及之后已经积累了足够的数据说明其可用于多种疾病的治疗。
沙利度胺可以被看成是这类药物的lead。90年代中叶,新基和洛克菲勒大学的药物化学家和药理学家们开始对沙利度胺进行了全方位的改造,以期找出效果更好、副作用更低的IMiDs化合物。

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后续上市的来那度胺就是来自对沙利度胺的改造,如上图所示,来那度胺的结构和沙利度胺非常的而类似,相比沙利度胺,来那度胺的的Glutarimide完全没有变化,在phthaloyl部分只多了一个氨基,少了一个羰基。
但这并不是随机的对沙利度胺的改造,在上世纪90年代末期,新基的首席科学家David Stirling领衔的化学家合成了成千上万的沙利度胺类似物来挑选更好的度胺类化合物,以期待更好的效果和更低的副作用,同时期待这种新的化合物还能对沙利度胺耐药的患者有效。
最早的改造在phthaloyl和Glutarimide都有涉及,新基当时并不知道沙利度胺作用的具体SAR,对沙利度胺大范围的改造也有利于发现沙利度胺的具体的构效部位。当时对沙利度胺类似物的筛选评估主要集中在对TNF-α分泌的抑制,以及IL-10分泌的促进程度。体外筛选一开始用人PBMC,后来用人或鼠的全血细胞。体内动物实验则使用LPS处理的炎症小鼠模型。不仅观察潜在化合物的抗炎活性,也会观察其抗肿瘤活性。
1998年Gilla Kaplan研究发现,来那度胺可以刺激T细胞分泌IL-2和INF-γ,对度胺类药物的免疫调节作用的机制有前进了一大步。具体的靶点和最终机制在2010-2014年由日本和美国的科学家揭示,如前描述是CRBN驱动E3降解IKZF1所致。但上世纪90年代末的这些研究已足够为化学家提供改造沙利度胺提供重要的思路。
90年代末以沙利度胺作为lead对其进行改造主要是两个思路,一类是selective cytokine inhibitory drugs(SelCID)主要是抑制细胞活素TNF-α, 另一类是immunomodulatory drug(IMiD)主要是激活T细胞,这两种机制我们前面都有所描述,而对SelCID的改造主要集中在沙利度胺的Glutarimide端,而IMiD主要集中在phthaloyl端。如下图:

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典型的SelCID和IMiD

我们现在熟知的度胺类其实是IMiDs,看似简单的改构,无数的化学家、药理学家、生物学家、大公司和院校做出了巨大的努力。数以千计的化合物被合成,评估以及再优化、改造以及放弃。最终药学家们对其药理活性、水溶性、体内相互作用、生物利用度等进行深入研究和评估,以上工作终于造就了新基的重磅炸弹来那度胺。如下图来那度胺2002年完成了1期临床研究并于2006年获批上市。2021年,销售额突破了120亿美金。

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图片来源:Zeldis et al. A review of lenalidomide

除了来那度胺,新基还研发了泊马度胺等新一代分子胶的抗MM药物并陆续获批上市。在此期间新基的首席科学家 David Stirling领导了整个来那度胺类似物的开发和研究,在他手中,新基先后有5个产品获批上市,累计销售近1000亿美金。我们在新基早期发布的来那度胺类似物开发的文章中都能看到Stirling博士的身影。2019年初新基被BMS并购,如今在BMS的官网上,新基早期的多位从塞拉尼斯生物医药部门中出来的创始人中只有CSO Stirling博士以及CEO sol Barer两位创始人赫然在目,体现了BMS对这两位新基创始人的肯定和尊敬。
Stirling博士一直在新基呆到2008年,彼时新基的来那度胺已经上市销售2年,收入可观,在研产品线雄厚,赫然已经从一家小的biotec成功转型成了big pharm。Stirling博士曾回忆2008年左右的新基时说道:当时新基已经成为了一家大公司,大公司的决策体系和氛围并不是太适合Stirling博士的行事风格,那种小的研发公司独特的氛围以及开发药物的激情在大的公司似乎很难维持。彼时新基也开始了激进的并购策略,2008年Stirling离开新基,和新基的早期投资人Zaslow作为共同创始人一起开办了BiotheryX。

Stirling博士作为BiotheryX的CEO,公司在圣地亚哥有个实验室,由Frank Mercurio博士作为CSO开始运营,Frank Mercurio之前在Signal,后者在2000年被新基收购。我们前文也提到过Mercurio博士,他是新基蛋白质降解药物平台的早期开创者之一。而Stirling博士则完成了从CSO到CEO的转变,他把大部分的时间花在会议、管理和对外交流。BiotheryX两类核心产品,一类源自Stirling博士在新基时的IMiDs,另一类是CKI-α抑制剂。2010年,Stirling博士在听到日本团队鉴定出IMiDs主要的靶点CRBN后,他敏锐的感觉到基于这类化学骨架能开发出更多有潜力的药物来。Stirlin带领的团队迅速开发出多个针对CRBN的全新小分子结构(PHM蛋白平衡调节剂),10多种全新的母核。目前BiotheryX是除了新基之外拥有最大的CRBN结合的小分子降解药物库的公司。2021年底在BiotheryX的BTX-1188进入临床之际,同时BiotheryX获得了9200万美金的融资,以进一步推进BTX-1188的临床研究。目前在临床及上市的9个小分子降解剂(分子胶)中,新基占有6个,BiotheryX占1个,而剩余两个由C4和诺华所有。其中7个在临床分子胶降解剂与Stirling博士有关,Stirling博士在这个领域的影响力可见一斑。

 

07
溶酶体及其相关的蛋白降解技术
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至此我们已经花了很多篇幅在UPS系统及其药物的研发,在蛋白质降解领域,另一个重要的领域溶酶体也在近几年逐渐被人们关注。前文我们提到DUVE博士在上世纪50年代发现了溶酶体,但科学家只是观察到了溶酶体中大量的蛋白酶,但对其具体的功能仍不为所知。
之后溶酶体的一些生理作用逐步被科学界阐述,科学家们用电子显微镜也观察到溶酶体前体从称为吞噬体的杯状开放膜体开始形成,最终和溶酶体结合,从而使包裹在吞噬体中的细胞基质被降解。当Duve教授观察到这一现象时,他意识到细胞可以通过溶酶体降解自身的某些成分,并将这一过程命名为“自噬”。
但由于哺乳动物细胞的复杂性,溶酶体领域一直在DUVE教授定义的框架中前行,大部分学者开始用电镜来观察自噬现象。直到90代通过酵母揭示了溶酶体的自噬机制。
 1992年,溶酶体领域第二位重磅人物登上舞台,东京大学的Yoshinori Ohsumi发现了酵母中也存在自噬现象,在缺乏营养的情况下,酵母中的vacuole(功能与溶酶体类似)中充满了大量含有细胞基质的囊泡,这些囊泡来自细胞质并与溶酶体结合后被溶酶体处理。因此酵母可提供了一种简单可行的工具来研究自噬的分子生物学机制。
说来巧合,Ohsumi教授早年也在洛克菲勒大学工作,可惜在此期间他从来没见过DUVE教授,一开始他在Edelman教授的实验室研究淋巴细胞的有丝分裂。但随着50年代沃森克里克的DNA模型的发现,这一激动人心的领域促使Ohsumi加入Arthur Kornberg的实验室,并用酵母作为工具,从事DNA复制的机制研究。有段时间,Ohsumi用梯度离心的方法分离细胞中DNA,他注意到试管顶部有一层白色分层,出于好奇他在显微镜下观察并意识到这是高度纯化的酵母溶酶体类似物(vacuole)。这个偶然的发现为Ohsumi教授后期对自噬的机制研究奠定了基础。
上世纪70年代末,Ohsumi教授回到日本东京大学,一开始他准备研究细胞质膜,而vacuole一般都被认为是酵母细胞的垃圾处理站,很少有人有兴趣研究它,但隔壁实验室的Masashi Tazaw教授启发了Ohsumi,Tazaw教授认为vacuole是一种被低估的细胞器,拥有潜力巨大的功能。Ohsumi被说动了,基于之前在洛克菲勒大学的积累,他马上开发了一套高效分离vacuole的方案,虽然vacuole占了整个细胞体积的四分之一,但分离纯化后的vacuole膜的产量却极其低下,高效分离并获得足够的vacuole膜对Ohsumi教授的研究非常重要。在此基础上,Ohsumi教授很快证明vacuolar膜上的物质转运机制,V型ATPase,负责vacuolar上氨基酸和钙离子的转运。此外在电镜等光学设备的观察下,Ohsumi教授很快证明vacuole中存在众多的自噬体,电镜图像显示自噬体中含有与细胞质相同密度的核糖体以及各种细胞质结构和细胞器,表明自噬是一种非选择性降解过程。尽管vacuolar比哺乳动物溶酶体大得多,但Ohsumi教授观察到的整个酵母自噬的过程在拓扑结构上与哺乳动物细胞中的自噬过程一致,因此酵母可以用作研究自噬的理想模型。此外酵母作为模式生物最吸引人的特征是它的遗传易处理性,这使其在解开复杂的生物现象方面具有强大的应用潜力。
在当时,科学界对自噬机制一无所知,相关的基因及功能蛋白也无从知晓,在确定用酵母细胞作为自噬机制的研究对象后,找到一株自噬功能障碍的酵母就显得甚为重要。和之前UPS系统发现过程中一样,Hershko和VARSHAVSKY教授分别找到网织红细胞和ts85两种关键的哺乳动物细胞,这两种细胞对UPS机制的阐明起到了关键性的作用。Ohsumi教授急需一种自噬功能障碍的酵母株来开始阐明自噬的作用机制。Ohsumi教授的第一个硕士生,大弟子Miki Tsukada开展了这方面的工作,她在数千株酵母突变细胞株寻找对氮元素缺乏不敏感的酵母细胞,数十种突变的酵母细胞被筛选出来,这些突变的酵母细胞被假设认为自噬功能缺陷的酵母,克隆其相关缺失基因验证其与自噬相关,之后Ohsumi教授团队将这类与自噬相关的基因命名为APG,第一个APG基因APG1是一种蛋白激酶。在此基础上,Ohsumi团队接着开发了Pho8Li60分析,用于高通量的获得自噬相关的基因和蛋白,在这种分析平台的帮助下,更多与自噬相关的基因不断被发现。
1996年,Ohsumi离开东大,选择位于日本冈崎的国家生物研究所继续进行溶酶体的研究,在此阶段,Ohsumi实验室设施更加齐全,同时来自日本关西医科大学和美国霍普金斯大学的新成员加入团队。此期间APG蛋白在自噬中的相互作用被揭示,并进一步鉴定出自噬必需的18种蛋白并将溶酶体自噬机制的研究扩展到哺乳动物和植物细胞。此后全球更多的实验室不断的分离出自噬缺陷的突变酵母株,因此统一将这类自噬相关基因命名为ATG基因,但Ohsumi教授早先命名的APG基因仍保留其命名方式。因为Ohsumi教授团队在溶酶体相关基因和机制方面先驱性的工作,他获得2016年诺贝尔生理或医学奖。到2016年,科学家们鉴定出的ATG基因已经达到41种。
那么自噬的生理意义呢,细胞在什么时候,如何以及为什么会发生自噬,在发现自噬的机制后Ohsumi教授将继续追寻自噬本身存在的意义。一般认为在溶酶体系统中,细胞通过内吞来处理胞外的物质,而自噬是细胞在营养缺乏维持最低生存能量的一种自我调节的方式。早先人们认为自噬是无差别的,但一些研究也发现细胞可以有选择的自噬胞内物质,如一些线粒体等。
Ohsumi教授认为目前对自噬的研究仍处于婴儿期,作为细胞的基本代谢过程,自噬直接或间接与一些细胞代谢和生理途径相关,必须和胞内其他的物质、代谢、信号等整体的来看待。
回到溶酶体本身,溶酶体除了通过内吞和自噬来降解外来物质和细胞内废弃产物外,在代谢调节、转录调控以及营养感知方面也发挥了重要作用。一些研究发现溶酶体是细胞代谢调节的信号中心,控制着细胞的生长和发育。
这其中一个重要的感知模块就是我们熟知的mTORC1信号通路,前文中提到的rapamycin就是mTORC1复合物的配体之一。来自MIT的David M. Sabatini对mTOR信号通路有深入研究,Sabatini教授年少成名,他在学生时期就发现了mTOR信号通路,并在48岁当选美国科学院院士。他在对于mTORC1信号通路和溶酶体关系的研究颠覆了学界之前对于溶酶体的一些认识,溶酶体不仅是废弃蛋白或细胞器的处理站,同时也是细胞内外各种信号通路的整合中心,
Sabatini教授在其2010年的一项研究中发现,在营养极度缺乏的哺乳细胞中,mTORC1复合物分散在细胞质中,而随着营养成分的增加,特别是氨基酸,导致mTORC1复合物很快在溶酶体膜表面聚集。溶酶体在此起到了锚定mTORC1复合物的作用。溶酶体事实上是细胞内一个重要的器官,而不仅仅是垃圾处理系统,是一个细胞内信号传导的中间站。溶酶体整合了胞内外的各种信号,促进细胞的正常生长和增值,在极端的情况下,特别是缺乏氨基酸等营养物质时,mTORC1脱离溶酶体膜,相应的信号通路被抑制,但自噬此时被激活,通过获得消化非必要蛋白和细胞器,细胞获得营养,如氨基酸等,从而促使mTORC1复合物的再次聚集于溶酶体膜,发挥其促生长的作用。但这些研究仍旧只是冰山一角,溶酶体及其相关的自噬及其信号中枢作用仅仅是开始,仍有许多未知的功能和机制需要被发现。
相比UPS系统,溶酶体更加保守的存在于各种真核细胞,此外其作用机制和功能仍旧存在很多未解之谜,越来越多的研究发现溶酶体不仅仅是作为细胞的垃圾处理站,作为胞内细胞器,还存在很多至关重要的生理功能,如mTORC1信号传导等。但随着PROTAC等UPS系统相关的蛋白降解技术的兴起,一些科研工作者也逐渐意识到靶向溶酶体受体也有降解目标蛋白的潜力。在靶向溶酶体表面受体或自噬体受体的基础上,利用溶酶体相关的内吞、自噬等功能,在体内开发新的策略和药物来降解蛋白等生物物质也越来越引起人们的关注。
把目标蛋白运送到溶酶体内降解,也需要hijack溶酶体或自噬体表面的受体,和PROTAC分子利用UPS 系统一样,化学分子必须和E3链接发挥作用,靶向溶酶体的受体(LTRs)等是溶酶体降解药物的基础。代谢物质或蛋白酶进入溶酶体涉及溶酶体的起源和形成,胞外内吞和胞内自噬,靶向相关的受体和关键蛋白,利用其进入溶酶体是这一切的基础。如下图:
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图片来源:J. Med. Chem. 2021, 64, 3493−3507

2020年,斯坦福化学系的Carolyn R. Bertozzi教授(是位女士),利用溶酶体内吞的机制开发了LYTAC平台,用于细胞膜外目标蛋白的降解,LYTAC全称为溶酶体靶向嵌合体(Lysosome-Targeting Chimeras)。LYTAC靶向的受体是CI-M6PR和ASGPR,LYTAC主体分为两部分,与CI-M6PR结合的糖多肽以及和靶蛋白结合的抗体。2020年7月Bertozzi教授LYTAC文章在Nature发表。在Bertozzi教授发表文章的同一年,基于LYTAC技术的Lycia公司成立,并获得5000万美金的A轮融资。2022年Bertozzi教授因其在正交化学领域的突出贡献获得诺贝尔奖。
在LYTAC文章发表的前半年,也就是2019年12月份,日本东北大学的化学家Hirokazu Arimoto教授团队开发了一种靶向自噬体的嵌合小分子(AUTACs)。
早在2004年,大阪大学的Tamotsu Yoshimori教授(Ohsumi教授的弟子,在自噬在哺乳动物的机制研究做出卓越贡献)发现在链球菌入侵细胞后,细胞启动自噬程序来消灭病原菌。在大约10年之后,东北大学的Arimoto教授进一步阐明其作用机制,他发现在自噬体内的链球菌广泛存在S-鸟苷化的现象,而这种鸟苷化则依赖体内存在的8-nitro-cGMP。在8-nitro-cGMP的作用下,鸟苷化的细菌被泛素化,之后被自噬体吞噬。鸟苷化引起自噬的机制被揭示后,Arimoto利用这个机制来设计AUTACs,AUTACs类似PROTAC,一段含有鸟苷衍生物,用于激发自噬,中间是linker,另一端则是靶蛋白配体。在此基础上,日本的科学家成功利用AUTACs降解了胞内靶蛋白和碎片化的线粒体。但AUTACs也存在一些问题,如设计比PROTAC更加复杂,机制也比较繁琐,涉及的问题更多,最重要的是PROTAC一般在1小时内就可降解靶蛋白,而AUTACs则需要数小时,Arimoto教授及其团队目前也在着手改进AUTACs,设计二代AUTACs,以期待未来有所突破。
Tamotsu Yoshimori教授是Ohsumi教授的得意弟子,除了链球菌入侵细胞的自噬外,早在2000年他就首次在哺乳动物自噬体上发现了LC3蛋白,这是一种在自噬体形成过程中拥有独特作用的蛋白,被认为是自噬体的“good marker”。LC3蛋白在哺乳动物自噬体引用超过7000次,足见其影响力之深。
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虽然上世纪50年代,Duve教授就发现了溶酶体并提出了自噬的概念,但科学界对这种单膜系统的细胞自身消化的系统的兴趣也很快消散,一方面是溶酶体的降解机制,直到东京大学的Ohsumi教授对自噬分子机制的研究做出了重要阐述,但另外一个重要的原因则是因为以蛋白酶体为核心的USP系统的崛起。UPS更加吸引人们的原因是:相比溶酶体系统,UPS系统一个组织严密、结构明确的系统,并且在UPS系统作用中,蛋白水解的过程更快,最重要的是UPS系统的选择性更强。在UPS系统各组分精准的协作调控下,可以精准的降解目标蛋白。
而这种UPS系统的高选择性,当时在溶酶体系统中是不可想象的,机体赋予了UPS系统快速精准的降解目标蛋白,使得细胞很快的适应环境的变化。正如我们前文所说UPS系统在上世纪80年代至今都是蛋白降解领域甚至是整个生物系统中的最大热门领域。但绝对的事情往往是不存在的,事物存在和发展的规律往往告诉我们不存在绝对的黑白和正反,对于细胞的两大降解系统来说,并不是UPS负责了所有的“精确有选择性的”降解,而溶酶体则是极端条件下的“一股脑”全部降解。在有些情况之下,科学家们也观察到了溶酶体可以选择性的降解一些目标蛋白。
这就要提到这个领域的一位重要科学家:美国塔夫茨大学的J.Fred Dice教授以及其他发现的CMA,即分子伴侣介导的自噬。
Dice教授15岁就患上了1型糖尿病,因此早年一直做糖尿病相关的机制研究,70年代末期,在UCSC期间,Dice教授一直在研究糖尿病引起的不受控的蛋白降解,很多实验结果表明这种降解主要是溶酶体主导的,同时Dice教授发现在细胞质中只有部分胞质蛋白的降解受此影响,而其他蛋白则不受其影响。这些发现让Dice教授一些提示:溶酶体也可以有选择性的降解一些蛋白。
1978年到1985年期间,Dice教授在哈弗医学院Fred Goldberg实验室做博后,Goldberg教授在前文提过,蛋白降解领域大咖,蛋白酶体发现者,美国科学院院士。在离开Goldberg实验室后,Dice教授继续研究蛋白质在哺乳动物中的降解。在此期间,Dice教授首先用红细胞作为载体把放射性标记的蛋白质导入到人的成纤维细胞中,成纤维细胞由于缺少生长因子,因而可以激活溶酶体介导的自噬。使用这种方法,Dice教授观察到与胰岛素缺乏的组织中类似的蛋白降解。很快,他们就分离出了被溶酶体选择性降解的蛋白RNase A。
在这之后,为了搞清楚溶酶体选择性降解蛋白的机制,Dice教授设计了一系列目标蛋白,当时他们使用了RNase A及其衍生蛋白。1983年,Dice教授实验室发现但他们注射RNase A蛋白到之前设计的降解系统后,RNase A蛋白被降解,而其衍生蛋白RNase S则不会降解,他们之间的差别只是RNase A蛋白比RNase S多了20个氨基酸,进一步研究发现,凡是含有类似KFERQ序列的蛋白,都可以被选择性的降解。Dice教授做了进一步的研究,发现凡是和KFERQ抗体相结合的蛋白,都可以被选择性的降解,所以用“含有类似KFERQ序列的蛋白能被选择性降解”表述更为合适。
Dice教授一开始认为KFERQ序列可以与与溶酶体的某种膜蛋白直接结合后被降解,但后续研究发现KFERQ序列与热休克蛋白HSC70结合后才会进入溶酶体。2000年,这一过程被命名为分子伴侣介导的自噬(CMA)。
不论是作为溶酶体膜标志物的LC3还是选择性自噬CMA中的分子伴侣都有潜力作为蛋白降解的底物来使得目标蛋白靠近溶酶体,从而利用靠近(proximity)的原则来达到降解目标蛋白的作用。相比利用UPS系统的降解药物,溶酶体降解还处于早期阶段,也涉及了更加复杂的机制,溶酶体作为细胞内的器官,在细胞内发挥了除了蛋白降解外更多的生理功能,就像诺贝尔奖获得者Ohsumi教授所言:目前对溶酶体及其自噬的研究仍处于婴儿期,这个领域仍具有很多的未知之谜。

08
简单小结
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Craig教授近年来风光无限,屡获大奖,2020年获得Heinrich Wieland 奖,2021年获得Scheele奖,后者一般是奖励对医药领域做出重大贡献的学者,前几届的获奖者如CRIPSR发明人Emmanuelle Charpentier、格列卫的发明人Charles L Sawyers以及modern的科学创始人Rober longer。
英国Dundee大学的Alessio Ciulli的教授认为蛋白降解药物的开发是一个全新的领域,这个领域打破了之前制药界对成药性约定成俗的规则。除了众多令人兴奋的不可成药靶点,对于药效的提高,蛋白降解药物也有巨大的优势,这个领域的前景无限,Ciulli教授认为:这只是时间问题。
毫无疑问,PROTAC、分子胶等新一代小分子药物将引领未来数年甚至数十年小分子新药领域的研发,这个领域的先驱Stuart L. Schreiber教授认为就像新的遗传工具引领合成生物学一样,用基因改造工具对细胞进行重新布线,分子胶等新一代小分子则可以在细胞内蛋白质水平上重新对细胞进行布线改造。此外用分子胶诱导新蛋白相互作用和调节具有挑战性的不可成药靶点稳定其他动态蛋白质关联。就像Schreiber教授开创了化学生物学一样,这类药物也开创了一个全新的小分子药物时代。
虽然在药效、不可成药靶点有着巨大的优势,但这类药物在药理药代毒理等传统小分子成药性评价系统也具有非常大的挑战,在靶点性质、效用机制、ADME/DMPK、选择性机制等都和传统抑制剂有较大区别,利用现有的经验积累形成一定的新规则,这些新的规则对这类药物的开发至关重要,在这方面,极少数拥有这类知识和经验积累的药学家极为重要。新的经验产生新的规则,就像之前根据占位驱动的机制,小分子成药一般会遵循Lipinski “成药性”设计的“类药五原则”,分子量越小的药物成药性越好,透脑效果越好,但事实上,ARVINAS的的PROTAC分子尽管分子量较大,但既能口服也有一定的透脑效果。可见对于蛋白降解药物来说,传统的“类药五原则”设计的思路并不适合。作为事件驱动、酶催化驱动作为机制的小分子药物来说,新的原则也许会在未来多年基于现有和不断积累的经验逐步形成。

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图片来源:Annual Reports in Medicinal Chemistry, Volume 50 ,ISSN 0065-7743
很多学者,不管是致力于基础机制研究的科学家、药物化学家、化学生物学家、药理学家等都在推动这一领域的日新月异,这无疑都开创了一个制药的新时代,就像之前的激酶抑制剂、基因编辑药物以及核酸药物,以蛋白降解药物为代表小分子的下一个时代即将来临。
在蛋白降解药物的发展历程中,令人兴奋的背后是众多的科学家多年的积累和坚持,不论是目前已经上市来那度胺还是多个进入临床的蛋白降解药物绝不是偶然的发现。而是多年基础研究、转化医学加之产业界科学家门不断研究积累的结果。
在早期对于UPS系统的阐明中,Hershko博士和VARSHAVSKY博士若不是在各自的领域坚守多年,根本不可能对领域进展保持很高的敏感,他们虽都是“偶然”看到一些文章,但必须结合自己过往经验,对UPS系统的关键功能和特性产生的一些蛛丝马迹产生共鸣,再通过自己过往的积累才能完成最终的验证。
就像自噬机制的奠基人Ohsumi教授所说,他对基础研究一直保持着好奇,但对后续这些理论的应用却不感兴趣,30多年来,他沿着酵母系统-vacuole自噬机制和蛋白-自噬蛋白相互作用-哺乳动物自噬-植物细胞自噬以及自噬的来源进行的一系列刨根问底的研究也令人敬佩不已。
而在应用科学领域,Crews教授多年在小分子对各种生理功能调节作用的研究,多年用化学生物学的方式来探索新的治疗方式,在UPS系统的应用中,从蛋白酶体抑制剂到PROTAC,Crews教授仍在继续着其传奇的经历。从科学概念验证到应用领域,Crews实验室无疑是最成功的学界范例。
在产业界,新基的沙利度胺和来那度胺被有些人认为是基于偶然发现,但事实上新基早在20多年前就在布局蛋白降解药物的平台,在30多年前就和洛克菲勒研究所在度胺类药物的免疫学机制上不断地探索和积累,在分子胶类的蛋白降解药物中独占鳌头,是基于其30多年的在化合物库及高通量生物筛选方法的的不断迭代,从SelCID到IMiDs直到CELMoDs无不代表其化合物建库和不断优化、理性反馈设计、高通量筛选的成果。
虽然沙利度胺到来那度胺在分子结构看只是微小变化,但背后却是数以千计的化学和生物学家数十年的努力、成千上万的化合物被合成及筛选。虽然目前蛋白降解领域仍在突飞猛进,新的技术层出不穷、新的方法和有潜力的化合物不断涌现,但对于一个新的领域来说,经验弥足珍贵,尤其是一个全新一代的小分子领域。
正如斯坦福的Paul A. Wender教授所言:做创新药,需要很多的业内资源,很多不同经验、技能和背景的人帮助去穿越创新的“死亡之谷”。这个历程中,需要好的化学家、药理学家、生物学家和临床专家,需要考虑投资、专利,远远超出一个人的能力范畴。

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备注:文中涉及图片未标注来源的,为呈益投研根据网上公开材料通过截图、编辑等方式自行设计。
 
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75、Hindawi, Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2020, Article ID 5457049, 12 pages https://doi.org/10.1155/2020/5457049

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77、Ota Fuchs, Blood Reviews, https://doi.org/10.1016/j.blre.2022.100994

78、Published on 07 October 2020 on https://pubs.rsc.org | doi:10.1039/9781839160691-00094

79、Nature Chemical Biology | VOL 17 | September 2021 | 947–953 |

80、Cell Chemical Biology 28, March 18, 2021

81、J. Med. Chem. 2021, 64, 3493−3507

82、Front. Cell Dev. Biol. 9:642494. doi: 10.3389/fcell.2021.642494

83、NATure RevIewS | Drug DiSCOvErY Reviews volume 18 | December 2019 | 923,https://doi.org/10.1038/

s41573-019-0036-1

84、Cell 184, January 7, 2021 @2020 Elsevier Inc

85、Cell Chemical Biology 28, March 18, 2021 @2021 Elsevier Ltd. 283

86、bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2022.07.02.498551; posted July 3, 2022.

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