mRNA疫苗的设计和载体

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前言

疫苗是预防传染性疾病传播的最有效的公共卫生干预措施。成功的疫苗接种根除了许多威胁生命的疾病,如天花和脊髓灰质炎,世界卫生组织估计疫苗每年可防止200-300万人死于破伤风、百日咳、流感和麻疹。然而,尽管常规疫苗取得了明显的成功,但它们并不能有效对付疟原虫、丙型肝炎和HIV等逃避免疫监视的病原体。此外,它们需要定期修改以应对快速变异的病原体,如流感病毒。


基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的,希望能产生安全、多功能、易于生产的疫苗。mRNA疫苗比传统疫苗有许多优点:与某些病毒疫苗不同,mRNA不会整合到基因组中,从而避免了对插入突变的担忧;mRNA疫苗可以以无细胞的方式制造,从而实现快速、经济、高效的生产。此外,单个mRNA疫苗可以编码多种抗原,增强针对适应性病原体的免疫反应,并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。


最初,由于担心其稳定性、低效性和过度免疫刺激,mRNA治疗并没有得到重视。然而在过去的十年中,mRNA治疗领域日新月异,包括mRNA药理学的深入研究,有效载体的开发和mRNA免疫原性的控制,使得mRNA疫苗的临床应用进入了一个崭新的阶段。


mRNA的设计与合成

体外转录(IVT)mRNA模拟内源性mRNA的结构,有五个部分,从5ʹ到3ʹ包括:5ʹcap,5ʹ非翻译区(UTR),一个编码抗原的开放阅读框,3ʹUTR和一个PolyA尾。


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与天然真核mRNAs一样,5′端帽结构包含一个7-甲基鸟苷核苷,5′端结构会在空间上保护mRNA不被核酸外切酶降解,并与翻译起始因子蛋白协同工作,招募核糖体以启动翻译。PolyA尾的长度间接调节mRNA翻译和半衰期。

编码区两侧的5′和3′UTR调节mRNA翻译、半衰期和亚细胞定位,来自高表达基因(如α-和β-珠蛋白基因)的天然UTR是合成mRNAs的首选。此外,UTR可根据细胞类型进行优化,如通过去除3′UTR中的miRNA结合位点和富含AU的区域,将mRNA降解降至最低。

mRNA疫苗的开放阅读框是最关键的组成部分,尽管开放阅读框不像非编码区那样具有可塑性,但可以通过优化密码子,从而在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。例如,CureVac AG公司发现人类mRNA密码子很少在第三位有A或U,从而用G或C替换开放阅读框第三位的A或U。并将此优化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV,目前正处于III期试验阶段。

为了最大化翻译,mRNA序列通常包含修饰的核苷,例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物。修饰核苷的使用,特别是修饰尿苷,阻止了模式识别受体的识别,保证了翻译过程产生足够水平的蛋白质。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修饰。另一种避免模式识别受体检测的策略,由CureVac首创,使用序列工程化和密码子优化,通过提高疫苗mRNA的GC含量来消耗尿苷。

除了mRNA序列的改进外,在简化mRNA生产方面也取得了重大进展。临床上使用的合成mRNA通过使用噬菌体RNA聚合酶T7(也可以使用T3和SP6聚合酶)从DNA质粒在体外转录。另外,使用CleanCap的共转录封盖技术,简化了纯化步骤。

mRNA疫苗的载体

由于mRNA较大(104–106Da)且带负电,因此无法通过细胞膜的阴离子脂质双层。此外,在体内,它会被先天免疫系统的细胞吞噬,并被核酸酶降解。因此,体内应用需要使用mRNA递送载体,该载体转染免疫细胞而不会引起毒性或不必要的免疫原性。目前,已经为此开发了许多基于创新材料的解决方案。


脂质纳米颗粒(LNP)

脂质纳米颗粒是临床上最先进的mRNA载体。截至2021年6月,所有正在研制或批准临床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP为mRNA递送提供了许多好处,包括制剂简单、模块化、生物相容性和较大的mRNA有效载荷容量。除RNA药物外,LNP通常包括四种成分,可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质,它们共同封装和保护脆弱的mRNA。


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可电离脂质与mRNA在酸性缓冲液中形成纳米颗粒,使脂质带正电荷并吸引RNA。此外,它们在内涵体的酸性环境中带正电荷,这促进了它们与内涵体膜的融合,将其释放到细胞质中。


DODAP和DODMA是第一种用于RNA输送的可电离脂质。通过设计提高DODMA的功效,产生了DLin-MC3-DMA。这是第一个FDA批准的药物制剂中使用的可电离脂质:siRNA药物patisiran(Onpattro)。除了有效且安全地递送siRNA外,DLin-MC3-DMA还用于mRNA的递送。


目前,学术界和工业界的许多团体使用组合反应方案来合成潜在的传递材料,这种方法产生了许多有效的脂质,包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102(用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273)和ALC-0315(用于辉瑞疫苗BNT162b2)。


除了寻求提高疗效外,人们越来越关注提高药物的特异性,特别是对疫苗和免疫疗法的特异性。含有多环金刚烷尾的脂质11-A-M58,和含有环咪唑头的脂质93-O17S59,已被设计用于体内靶向T细胞。尽管机制尚不清楚,但这些脂质的环状基团对于靶向T细胞至关重要。


尽管电离脂质可以说是LNP最重要的成分,但其他三种脂质成分(胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质)也促进了纳米粒子的形成和功能。胆固醇是一种天然存在的脂质,它通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性,并有助于在摄取到细胞的过程中与内涵体膜融合。


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辅助脂质通过促进有助于膜与内涵体融合的脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强功效。最佳辅助脂质的选择取决于可电离脂质材料和RNA载体。例如,对于类脂质材料,饱和辅助脂质(如DSPC)最适合传递短RNA(如siRNA),而不饱和脂质(如DOPE)最适合传递mRNA 。DSPC已被用于FDA批准的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。


LNPs的聚乙二醇化脂质成分由聚乙二醇(PEG)与锚定脂质(如DMPE或DMG)结合而成。亲水性PEG可以稳定LNP,通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小,并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂质。


聚合物和聚合物纳米颗粒

尽管临床进展不如LNP,但聚合物具有与脂质相似的优势,能够有效传递mRNA。阳离子聚合物将核酸浓缩成具有不同形状和大小的复合物,可通过内吞作用进入细胞。


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聚乙烯亚胺是研究最广泛的核酸传递聚合物。尽管其功效卓越,但由于其高电荷密度,其毒性限制了应用。此外,已经开发出几种毒性较小的可生物降解聚合物。例如,聚(β-氨基酯)在mRNA传递方面表现出色,尤其是对肺。

最近开发出了一种新型的含脂聚合物,称为电荷改变可释放转运体(CARTs),它能有效地靶向T细胞,操纵T细胞是非常困难的,因此,CART 是一种极具吸引力的传递材料,在mRNA疫苗和基因治疗领域具有巨大潜力。


其他递送系统

除了脂质和聚合物载体外,肽也可以将mRNA传递到细胞中,这要归功于其主链和侧链中的阳离子或两亲胺基(例如精氨酸),这些阳离子或两亲胺基与mRNA静电结合并形成纳米复合物。例如,含有重复的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(RALA)基序的膜融合细胞穿透肽。


富含精氨酸的鱼精蛋白肽在中性pH下带正电荷,也可以浓缩mRNA并促进其传递。鱼精蛋白与mRNA复合物激活识别单链mRNA的Toll样受体(TLR7,TLR8)通路,因此,它还可以作为疫苗或免疫治疗应用的佐剂。CureVac AG正在评估一种含有鱼精蛋白的递送平台RNActive,用于黑色素瘤、前列腺癌和非小细胞肺癌的临床试验。


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最后,基于角鲨烯阳离子纳米乳液也可以传递mRNA,这些纳米乳剂由油性角鲨烯核组成。一些角鲨烯制剂,如诺华的MF59,在FDA批准的流感疫苗中用作佐剂。MF59使注射部位的细胞分泌趋化因子,从而招募抗原呈递细胞,诱导单核细胞分化为树突状细胞,并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取。角鲨烯基阳离子纳米乳剂从内涵体逃逸并将mRNA输送到细胞质中的机制尚不清楚。


mRNA疫苗技术创新

mRNA疫苗技术最重要的创新在于:mRNA 序列设计;开发简单、快速和大规模生产 mRNA 的方法;开发高效、安全的 mRNA 疫苗递送材料。


最近的一项研究使用了一种基于细胞培养的系统选择过程来识别新的UTRs,它显著增加了IVT mRNA的蛋白质表达。与人类β-珠蛋白3’UTR的相比,这些序列可以诱导相关转录物产生大约3倍的蛋白质。


此外,最近报道了一种有趣的新疫苗形式,该方法利用编码α病毒RNA依赖性RNA聚合酶的mRNA加上编码抗原的第二个mRNA,使其在细胞质中能够复制。这种系统可以在非常低的剂量(50ng)就有效地诱导小鼠的保护性免疫反应。这些发现特别有吸引力,因为低剂量的使用降低了疫苗生产的成本。无递送材料进一步降低了成本,简化了制造,并且提高了疫苗冻干和在环境温度下储存的可能性。


在生产方面,除了cleancap技术外,最近开发了一种通过将双链RNA污染物吸附到纤维素(一种廉价且丰富的多糖)来纯化mRNA的简单方法。研究证明,这种高度可扩展且廉价的方法与高效液相色谱法一样有效地去除IVT mRNA样本中的dsRNA污染物。


在递送材料方面,与基于聚合物的CART平台类似,mRNA-LNPs也实现了选择性T细胞靶向。一种新的平台,称为ASSET(锚定二级靶向单链抗体),其中T细胞特异性单克隆抗体与LNP相连,以靶向T细胞。这种灵活的平台在mRNA疫苗和其他应用方面也有很大的潜力。


另外一种脂质复合物在全身给药后优先靶向树突状细胞。用mRNA疫苗选择性靶向DC以诱导强烈的免疫反应是一个潜在的关键发现,该平台已经在临床试验中证明了其前景。


小结

过去几年在mRNA疫苗领域取得了极其重要的进展,并为这种新型疫苗模式的可行性提供了证据。新的制造方法和递送材料将有助于快速、廉价地大规模生产下一代mRNA疫苗。同样还有许多地方需要深入研究,以及更全面地了解各种mRNA疫苗类型的作用机制,以进一步地优化mRNA疫苗技术。


参考文献:

1. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat RevDrug Discov. 2021 Aug 25 : 1–22.

2. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug;65:14-20.


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