“眼见为实”：袁正宏课题组 “绘制”乙肝病毒在肝细胞内的复制时空动态全景图

2021年8月9日，国际病毒学权威学术期刊 PLOS Pathogens 在线发表了复旦大学上海医学院医学分子病毒学重点实验室袁正宏课题组与复旦大学附属公共卫生临床中心共同合作的题为“Probing the spatiotemporal patterns of HBV multiplication reveals novel features of its subcellular processes”的研究论文。课题组利用独立原创的高灵敏荧光原位杂交（FISH）方法揭示了HBV 感染肝细胞的核酸动力学及细胞核内病毒共价闭合环状DNA (cccDNA)表观遗传学特性，分析了病毒前基因组RNA (pgRNA)在单分子层面的翻译与复制包装的序贯过程，揭示了细胞微管结构在核衣壳运输和病毒成熟分泌过程中的关键作用。

“眼见为实”：袁正宏课题组 “绘制”乙肝病毒在肝细胞内的复制时空动态全景图

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是世界性的重大公共卫生问题。世卫组织报道全世界约有2.57亿人慢性感染乙肝病毒，约有88.7万人死于与乙肝病毒感染相关的终末期肝病，如肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。由于HBV具有高度复杂的复制增殖机制，已有的治疗手段尚不能治愈乙肝，进一步加深对HBV复制周期关键环节的认识可以为乙肝的彻底治愈提供新的线索。

前人对HBV生命周期的研究主要依赖密度梯度离心、Southern和Northern blot等一系列经典分子生物学技术。然而，上述方法无法提供病毒在细胞内的精确定位，损失了与多种亚细胞器的相互作用的关键信息。袁正宏实验室利用基于bDNA的荧光原位杂交结合免疫荧光技术，开发了一种用于多重检测病毒核酸和蛋白质的显微成像方法，其优势在于能够定量出单细胞水平病毒核酸的表达差异，以及不同类型病毒核酸在细胞核与细胞浆之间的分布特征。

研究人员首先证实了HBV子代病毒核酸缓慢复制的动力学特征，同时在单细胞水平揭示了病毒复制的高度异质性。接着通过直接观察细胞核内cccDNA与关键表观遗传标记（组蛋白H3赖氨酸27位点乙酰化（H3K27ac）和RNA聚合酶II（Pol II））的共定位，定量分析了病毒微小染色体与转录激活相关标记的共定位。此外，还进一步证实了Smc5/6复合物在感染的原代肝细胞中被降解，而在感染的HepG2-NTCP细胞中无明显降低，提示在肝癌细胞系中这一通路与正常肝细胞有显著差异。

在细胞浆中的病毒活动方面，课题组在单分子水平定量分析了病毒前基因组RNA (pgRNA)与核糖体和核衣壳的共定位情况，证实pgRNA作为蛋白翻译模板和核衣壳包装的基因组前体是序贯发生，无法同时完成的独立分子事件，且后者较前者更加缓慢。最后，研究发现尽管细胞微管结构被小分子抑制剂破坏后核衣壳仍可以组装，但核衣壳的胞内运输受阻，滞留于细胞核周。此外，微管还为多囊泡小体(Multivesicular Bodies, MVBs)中的小囊泡融合介导病毒粒子分泌出胞提供了细胞内“高速公路”，揭示了病毒如何利用胞内结构有效产生成熟病毒颗粒的策略。

“眼见为实”：袁正宏课题组 “绘制”乙肝病毒在肝细胞内的复制时空动态全景图

这项研究主要利用可视化技术证实了HBV关键复制环节的现有知识，并且在亚细胞水平可直接观察病毒组分利用宿主因子进行复制的关键机制，填补了HBV生活史中一些关键环节的时空信息，深化了对 HBV 感染的认识，为开发新的抗病毒策略提供了崭新视角。同时，该研究开发的相关方法也为研究病毒组分与宿主间的相互关系提供了有力的技术支撑。

该研究得到了国家自然科学基金重大研究计划、国家科技重大专项、广东省珠江人才计划地方创新团队项目、中国医学科学院医学创新基金、上海市科委基础研究重大专项的资助。此次发表的研究论文，岳蕾和李畅为第一作者，袁正宏研究员和张小楠研究员为共同通讯作者。徐明珠、邬敏、丁家惠和刘江霞等也为该研究作出了重要贡献。