Science Advances | 重大进展!厦门大学杨朝勇团队开发新的技术,极大提高单细胞测序性能

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iNature

单细胞全基因组测序(WGS)对于表征DNA中动态细胞间变化至关重要。当前用于单细胞WGS的样品制备技术复杂,昂贵,并且存在高扩增偏差和误差。

2020年12月9日,厦门大学杨朝勇团队Science Advances 在线“Digital-WGS: Automated, highly efficient whole-genome sequencing of single cells by digital microfluidics”的研究论文,该研究描述了Digital-WGS,这是一个样品前处理平台,可基于数字微流体的自动处理功能来简化高性能单细胞WGS。

使用该方法,该研究通过湿润的流体动力学结构为任何数量和类型的细胞提供了高单细胞捕获效率。在封闭的疏水界面中对液滴进行数字控制,可以完全去除外源DNA,充分的细胞裂解以及无损扩增子回收,从而在多个规模上实现了低变异系数和高覆盖率。单细胞基因组变异分析可对150 kb最小条带的拷贝数变异和等位基因缺失率为5.2%的单核苷酸变异进行出色的检测这对于单细胞基因组测序有广阔的应用前景。

 

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单细胞基因组学揭示了传统批量表征中所隐藏的基因组异质性,使得能够在单细胞水平上对多种生物过程的基因组变异进行探究。目前,单细胞基因组测序技术已广泛用于解决早期胚胎发育,肿瘤异质性和神经体细胞镶嵌术,并且在细胞遗传学上非常需要。然而,单细胞基因组学依赖于全基因组扩增(WGA)来扩增单细胞的基因组DNA,以产生足够的重复序列进行测序,可能导致扩增偏倚和覆盖率的丧失。
为了通过分子或微流体策略提高WGA性能,已经进行了相当大的努力。分子策略将高保真DNA复制或线性扩增步骤纳入流程,以提高一致性,扩大覆盖范围或降低错误率,包括简并的寡核苷酸引发的聚合酶链反应(DOP-PCR),多置换扩增MDA),多个基于退火和循环的扩增循环(MALBAC)和通过转座子插入的线性扩增(LIANTI)。其中,MDA是使用最广泛的方法,它在等温条件下通过随机引物和链置换以指数方式扩增DNA。与其他WGA方法相比,MDA易于执行,并具有更高的保真度和覆盖率。不幸的是,由于指数扩增,MDA表现出相当大的偏差,并且在拷贝数变异(CNV)检测中具有较低的精度和灵敏度。
微流控策略可在微流控设备(纳升或皮升)中实现小反应体积的核酸扩增,已被用于减少非特异性和重复引发,并且先前已证明可用于PCR,MDA和MALBAC。总体而言,在现有技术条件下,基于液滴的方法无法在集成微流控芯片中执行高效,自动化和强大的单细胞WGA。理想的单细胞WGA方法应整合样品制备中的所有主要步骤,并提供高细胞捕获效率和通量,同时在整个基因组中保持高一致性和准确性的数据质量。
数字微流控(DMF)是一种新兴的微流控自动化技术,可通过电介质上电润湿(EWOD)现象处理电极阵列上微升至纳升大小的液滴。通过向这些电极施加一系列电势,可以单独控制液滴,以从容器中合并,混合,分离和分配液滴。与基于通道的设备和移液机器人等现有的流体处理系统相比,DMF在非接触式和可寻址液滴操作,灵活且通用的芯片设计以及无损样品处理和回收方面提供了众多优势。DMF最近已用于执行基于细胞的测定,为细胞培养和分析提供了复杂而多步骤的实验能力,例如在微流体平台上进行的首次自动细胞培养。
在这里,该研究开发了Digital-WGS,这是一种基于DMF的单细胞样品制备平台,该平台集成了并行纳升体积MDA的所有主要步骤,包括从单细胞分离到WGA的自动处理。通过在DMF芯片上结合流体动力学和表面润湿性,无论细胞类型和输入如何,都可以通过液滴操作自动有效地(100%)分离单个细胞。Digital-WGS允许在所有步骤中对液滴进行可寻址的控制,以大大提高裂解效率和反应的均匀性。可寻址和非接触式工作流程减少了与污染物或内源性背景的竞争,从而提高了基因组模板的有效浓度。
该研究应用Digital-WGS进行了许多单细胞纳升体积的MDA反应,并使用低深度和深度全基因组测序(WGS)将性能与其他已报道的MDA方法进行了全面比较。该结果表明,Digital-WGS在多个方面都优于现有的MDA方法,从而大大降低了放大偏差和指数放大误差。使用该方法,该研究能够以最小的150 kb bin和等位基因剔除(ADO)率为5.2%的单核苷酸变体(SNV)实现出色的CNV检测。因此,Digital-WGS提供了解决WGA当前问题的独特途径,从而为执行单细胞测序提供了一种有效而强大的方法。这种方法对于单细胞分析的任何化学方法都具有可扩展性和通用性,这对于单细胞基因组测序有广阔的应用前景。
参考消息:
https://advances.sciencemag.org/content/6/50/eabd6454

 

 

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