打破传统E3泛素连接酶，挖掘新型E3泛素连接酶FBXO22的NSD2降解剂

蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是近几年比较火的一门研究领域，因可靶向不可成药靶点等优点而备受重视，但是它也有分子量大，口服生物利用度低等缺点。

PROTACs常用的E3连接酶是VHL和CRBN，但是它们各自有局限性，如对于VHL低表达的肿瘤基于VHL的PROTACs可能达不到理想的效果，因此发掘新型E3连接酶很有必要。

NSD2是一种组蛋白甲基化酶，它的异常表达与很多肿瘤相关，是一个很好的肿瘤靶点。

此前，金坚教授课题组报道了基于CRBN的NSD2降解剂MS159，随后Cheryl H. Arrowsmith和Lindsey I. James教授报道了新型的NSD2降解剂UNC8153。

为了探索UNC8153这一类型的降解机理，Cheryl H. Arrowsmith和Lindsey I. James教授继续报道了第二代 NSD2 降解剂UNC8732并发现它是通过招募新型E3泛素连接酶FBXO22来实现降解的，为PROTACs的发展提供更多可能性。

PROTACs的局限性

靶向蛋白质降解（TPD）是一种基于邻近性的药理学策略，利用泛素-蛋白酶体降解目标蛋白。

PROTACs是一种异双功能小分子，由目标蛋白（POI）的配体、E3 泛素连接酶配体，例如 von Hippel−Lindau（VHL）或cereblon (CRBN)和用于连接两个配体的连接链。PROTACs诱导 POI−PROTAC−E3泛素连接酶形成三元复合物，导致目标蛋白被多泛素化，进而被蛋白酶体所降解[1]。

打破传统E3泛素连接酶，挖掘新型E3泛素连接酶FBXO22的NSD2降解剂

图1. PROTAC的作用机制

在过去的二十年里，人们对 TPD 技术的兴趣激增，使得越来越多的靶点可被降解。然而，E3 泛素连接酶的扩增并未以相同的速度发生。人类基因组编码 600 多种不同的E3泛素连接酶[2]。实际上，大多数靶向蛋白降解剂仍然通过招募两种 E3 连接酶VHL或 CRBN，这种限制给 TPD 领域带来了许多障碍。

首先，一些细胞类型缺乏VHL或CRBN的表达，因此，这些 E3 连接酶不是所有疾病普遍适用。例如，VHL在某些恶性肿瘤中表达下调，这限制了在这种情况下使用 TPD 作为治疗解决方案。

其次，每种E3连接酶都会带来其独特的挑战。例如，VHL配体是天然 VHL 蛋白的拮抗剂；鉴于VHL是众所周知的肿瘤抑制因子，因此，其应用可能并不理想。CRBN配体，例如免疫调节剂来那度胺、沙利度胺和泊马度胺，可以降解已知的Neo-substrate，包括 SALL4、IKZF1 和 IKZF3，这可能会导致脱靶降解。

最后，许多TPD异双功能化合物分子量相对较大，超过了传统小分子药物的大小。这可能会导致细胞渗透性和药理特性较差，需要进行广泛的优化，并且限制其临床使用。

为了克服这些挑战，这就需要提供多种新型E3泛素连接酶，充分发挥靶向蛋白降解的潜力。

打破传统E3泛素连接酶，挖掘新型E3泛素连接酶FBXO22的NSD2降解剂

NSD2与肿瘤的关系

NSD2（Nuclear receptor-binding SET domain-containing 2），也称为WHSC1 和 MMSET，属于NSD 亚家族，是主要的赖氨酸甲基转移酶，在H3K36上进行二甲基化，与基因转录密切相关。

NSD2的异常表达或蛋白突变可以引起多种癌症。有研究表明，15−20%的多发性骨髓瘤（MM）患者存在NSD2 的过度表达。此外，NSD2 的E1099K功能获得性点突变在幼儿急性淋巴细胞白血病（ALL）病例中较多；在肺腺癌个体中也有检测到，突变会导致 H3K36me2上调，与恶性肿瘤进展相关。更为重要的是，NSD2 的基因敲除降低了H3K36me2水平，可以显著抑制肿瘤生长。因此NSD2是一个潜在治疗肿瘤的有效靶点[3]。

2款已报道的NSD2的PROTACs

2022年，金坚教授团队和北卡罗莱纳大学教堂山分校王刚（Dr. G. Greg Wang）团队合作在Journal of Medicinal Chemistry 杂志上发表研究论文，得到了首例能够选择性降解NSD2的PROTAC分子MS159。此外，MS159还可以降解造血转录因子IKZF1/3，对GSPT1不起作用[4]。

2023年加拿大结构基因组学协会多伦多实验室的首席科学家Cheryl H. Arrowsmith教授和北卡罗来纳大学教堂山分校埃舍曼药学院的Lindsey I. James教授。在JACS上发表文章设计了新型高选择性的NSD2靶向降解物UNC8153（图2）[5]。

图2. UNC8153和MS159的结构

UNC8153并没有传统意义上的CRBN或VHL配体，那么它是怎么降解NSD2的呢？

新型E3泛素连接酶FBXO22

最近加拿大结构基因组学协会多伦多实验室Cheryl H. Arrowsmith教授和北卡罗来纳大学教堂山分校埃舍曼药学院的Lindsey I. James教授在bioRxiv继续报道了第二代 NSD2 降解剂UNC8732（图3），提高了细胞中NSD2 的降解和 H3K36me2 减少。

与 UNC8153 类似，UNC8732 也包含一个烷基伯胺，最重要的是UNC8732招募FBXO22，SKP1、CUL1、F-box复合物（SCF^FBXO22）的亚基来促进NSD2 降解。而且，FBXO22 是一种 E3 连接酶，负责多种蛋白质的降解[6]。

作者首先通过限制酰胺键，形成更刚性和更有利的构象。使用这个策略，他们发现了UNC8732，它含有稠合双环系统，是一种高效的NSD2降解剂。它的DC50为 0.06±0.03 μM，Dmax为97±2%。由于UNC8732没有比UNC8153 更有效地结合NSD2-PWWP1，因此这种降解效率的提高不是与 NSD2 结合改善的结果，而是构象约束的结果。

图3. UNC8732的结构

对 UNC8732 和相关类似物如何促进NSD2降解的机制。作者进行了一次基于液相色谱-质谱 (LCMS) 的代谢物鉴定研究。U2OS细胞在DMEM培养基和 10% 胎牛血清 (FBS) 经过降解剂 UNC8732 (10 μM)处理，裂解物通过 LC-MS/MS分析，观察到UNC8732 醛衍生物的生成。在6小时内UNC8732的浓度迅速下降，降至检测限以下。醛代谢物在 6 小时后大量形成（图4A和B）。

接下来，作者在没有细胞的情况下将含有 FBS 的 DMEM 培养基与 UNC8732 一起孵育，同样观察到相应醛代谢物的形成，而UNC8732的水平在4小时后就降至检测限以下（图4C）。然而，当将UNC8732添加到不含FBS的DMEM培养基中，没有观察到醛代谢物的形成，表明胎牛血清中的胺氧化酶是造成这种转换情况的原因（图4D）。

在FBS存在的情况下，添加氨基胍 (AG)，一种泛胺氧化酶抑制剂，它可以以剂量依赖性方式抑制 UNC8732 的 NSD2 降解（图 2E）。最后，作者在存在 10% FBS 或不存在 FBS 的情况下，用 UNC8732 处理 U2OS 细胞。在里面没有 FBS的时候，没有观察到 NSD2 降解（图4F）。这些数据强烈表明UNC8732 代谢为醛是有效降解所必需的。

打破传统E3泛素连接酶，挖掘新型E3泛素连接酶FBXO22的NSD2降解剂

图4. UNC8732是代谢为醛类衍生物来降解NSD2

接着作者想探索哪个可能的E3 泛素连接酶募集并促进 NSD2 降解。作者使用邻近依赖性搜索生物素鉴定 (BioID)，一种基于邻近生物素化的技术，用于鉴定活细胞中蛋白-蛋白相互作用。来研究参与降解 NSD2 的候选E3泛素连接酶。

在UNC8732处理后，可以观察到FBXO22的显著富集（图5B-C），这是一个包含Neddylation 依赖性 SKP1-CUL1-F-box (SCF) E3 连接酶的底物识别亚基。SKP1 是一种接头蛋白，可将 F-box 蛋白（例如 FBXO22）与CUL1 相连。CUL1可以招募带有泛素的 E2 酶，以neddylation 依赖方式将泛素转移到底物上。除了 FBXO22之外，还有一些增加的与26S蛋白酶体亚基相互作用，包括PSMB1、PSMB5 和 PSMA5。

为了进一步研究UNC8732 介导的招募 FBXO22 到NSD2 ，作者进行了基于邻近的 NanoBRET 蛋白-蛋白相互作用测定来评估形成NSD2-降解剂-FBXO22 三元复合物的结构。

作者用U2OS细胞转染全长NSD2 的蛋白与纳米荧光素酶蛋白 (nanoLuc) 融合，FBXO22与共价结合 HaloLigand（Promega 618 配体）的HaloTag融合。在 UNC8732 浓度增加的情况下，生物发光共振以剂量依赖性方式在两种融合蛋白之间观察到能量转移（BRET）。表明这两种蛋白质在细胞中经过降解剂处理后可以相互接近（图5D）。

最后，为了确认 NSD2 降解对 FBXO22 招募的依赖性，进行了 siRNA 敲低研究。敲低任何一个SCF^FBXO22 复合体的组成，包括 CUL1、SKP1 或 FBXO22，都能够阻止 UNC8732介导的 NSD2 降解（图5E）。这些数据证实FBXO22 和 SCF 复合物是UNC8732介导的 NSD2 降解所必需的。总体而言，这些数据都支持 SCF^FBXO22作为 UNC8732 招募的 E3泛素连接酶复合物。

打破传统E3泛素连接酶，挖掘新型E3泛素连接酶FBXO22的NSD2降解剂

图5. UNC8732是通过招募FBXO22来降解NSD2

小结

这篇文章发现了通过招募FBXO22得到了NSD2 的高效降解剂。由此可见，FBXO22确实能够降解核蛋白如NSD2。而且FBXO22 在大多数细胞类型中表达，它是一种有前途的 E3 连接酶，可在 TPD 中广泛使用。除此之外，FBXO22它也被证明与正常组织相比，在人类各种类型的肿瘤组织中表达升高，进一步支持该 TPD 策略在肿瘤学中的应用。因此，这种新颖的 FBXO22 依赖的 TPD 策略有很大的潜力，可以来拓宽TPD治疗方法的范围。

参考资料：

1. Brandon Dale, Meng Cheng, Kwang-Su Park, H. ümit Kaniskan,Yue Xiong and Jian Jin, Advancing targeted protein

degradation for cancer therapy, Nature Reviews Cancer volume 21, pages638–654 (2021)

2. Liu, Y.; Yang, J.; Wang, T.; Luo, M.; Chen, Y.; Chen, C.; Ronai, Z. e.; Zhou, Y.; Ruppin, E.; Han, L., Expanding PROTACtable genome universe of E3 ligases. Nature Communications 2023, 14 (1), 6509

3. Jacob D Jaffe et.al, Global chromatin profiling reveals NSD2 mutations in pediatric acute lymphoblastic leukemia, Nat Genet. 2013 Nov;45(11):1386-91.

4. Meng, F.; Xu, C.; Park, K.-S.; Kaniskan, H. Ü.; Wang, G. G.; Jin, J., Discovery of a First-in-Class Degrader for Nuclear Receptor Binding SET Domain Protein 2 (NSD2) and Ikaros/Aiolos. Journal of Medicinal Chemistry 2022, 65 (15), 10611-10625.

5. Hanley, R. P.; Nie, D. Y.; Tabor, J. R.; Li, F.; Sobh, A.; Xu, C.; Barker, N. K.; Dilworth, D.; Hajian, T.; Gibson, E.; Szewczyk, M. M.; Brown, P. J.; Barsyte-Lovejoy, D.; Herring, L. E.; Wang, G. G.; Licht, J. D.; Vedadi, M.; Arrowsmith, C. H.; James, L. I., Discovery of a Potent and Selective Targeted NSD2 Degrader for the Reduction of H3K36me2. Journal of the American Chemical Society 2023, 145 (14), 8176-8188.

6. Nie, D. Y.; Tabor, J. R.; Li, J.; Kutera, M.; St-Germain, J.; Hanley, R. P.; Wolf, E.; Paulakonis, E.; Kenney, T. M. G.; Duan, S.; Shrestha, S.; Owens, D. D. G.; Pon, A.; Szewczyk, M.; Lamberto, A. J.; Menes, M.; Li, F.; Barsyte-Lovejoy, D.; Brown, N. G.; Barsotti, A. M.; Stamford, A. W.; Collins, J. L.; Wilson, D. J.; Raught, B.; Licht, J. D.; James, L. I.; Arrowsmith, C. H., Recruitment of FBXO22 for Targeted Degradation of NSD2. bioRxiv 2023, 2023.11.01.564830.