肿瘤细胞如何“服毒自尽”? 多款ADC药物内吞特征解析

前言

抗体-药物偶联物(ADC)通过将具有细胞毒性的有效载荷偶联到抗体上从而使靶向化疗的概念重新焕发生机。抗体偶联技术与靶向生物学科的重大研究进展加速FDA批准了多款ADC药物，其中2019年之后就有9款获批。获批的14款ADC药物中有7款针对血液肿瘤疾病，另外7款针对实体肿瘤，另外还有超过300款的ADC在研药物处于临床阶段，未来可期。

ADC领域的成功很大程度上归功于科学家们设计出的改进方法：将剧毒有效载荷结合到单克隆抗体上，使ADC能够在肿瘤细胞内以更高的效率递送细胞毒素，同时限制循环过程中毒素的过早释放。连接子类型、有效载荷、作用机制以及靶点的生物学特性都必须协调平衡才能产生预期的效果。值得注意的是，复杂的ADC胞内毒素传递过程的第一个阶段是ADC药物的内吞，毕竟被肿瘤细胞“吞掉”的毒药才可能起作用。

撰文 | 免疫背包客

部分获批的ADC药物和适应症

ADC药物相关内吞途径

正常的内吞作用可以分为三个阶段：(1)芽形成；(2)膜弯曲和囊泡成熟；(3)与膜分离并释放到细胞质。细胞存在多种多样的内吞途径并且有很大的重叠性，因此内吞过程是高度灵活和复杂的。与ADC药物相关的内吞途径主要包含：网格蛋白介导的内吞(CME)、细胞膜窝样内陷介导的内吞、凹陷蛋白非依赖性载体(CLIC)、富含GPI锚定蛋白的初级内体区室(GEEC)以及大型胞饮作用。

肿瘤细胞如何“服毒自尽”? 多款ADC药物内吞特征解析

部分获批的ADC药物内吞途径示意图

ADC/CD33靶点内吞

CD33是一种67kD的跨膜糖蛋白受体，通常在正常髓系细胞上表达，因其在AML细胞上会过度表达，因此是吉妥单抗GO的作用靶点。CD33蛋白胞内域包含两个ITIMs基序，其只要作用是通过调节信号来下调淋巴细胞的活化状态，但是研究表明它的ITIMs基序同时也调控CD33的内吞作用。ITIMs通过结合SHP蛋白激活网格蛋白介导的内吞，当CD33被磷酸化修饰后内吞作用明显增高，当ITIMs的磷酸化位点被替代为苯丙氨酸后内吞作用显著降低。值得注意的是，CD33被归为缓慢内化抗原行列，这是基于内化分析的结果，该结果显示约50%的CD33分子在Jurkat细胞中内化超过2小时，与低密度脂蛋白受体的内化速度相比速度明显较慢，后者表现出天然的快速内吞状态。有趣的是，同属于Siglec家族的CD22表现出持续的内吞现象，这可能与CD22含有更丰富的ITIMs基序有关。

CD33内化受损是吉妥单抗无效的一个重要原因。注射吉妥单抗后3-6小时，取自患者的AML细胞显示仅有25-40%的CD33内化，这种基于体内治疗的内化率与先前在AML细胞系上的体外研究结果一致。有趣的是，≥25%的CD33在吉妥单抗处理6小时窗口期内重新表达。因此尽管CD33可能经历缓慢的内化过程，但CD33在治疗窗口期的重新表达可使足够部分的吉妥单抗内化和分解，这是吉妥单抗有效杀伤AML细胞所必需的。

ADC/CD30靶点内吞

CD30是一种120 kD的跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，其胞外部分由六个半胱氨酸结构域(CRD)组成。CD30表达于活化的T细胞和B细胞以及各种淋巴样肿瘤细胞，包括霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。CD30因蛋白酶解裂而从细胞膜脱落的现象研究的非常详尽，其释放在与CD30配体阳性细胞相互作用时增强，抑制CD30脱落已被研究用来提高CD30靶向治疗药物的疗效，然而关于CD30内吞作用的研究却寥寥无几。

脱落是CD30生物学的一个特征，循环的可溶性CD30的浓度足以用作监测肿瘤进展的血清标志物。但就以CD30为靶点的ADC药物而言，升高的可溶性CD30浓度可能会阻隔注射的ADC药物与CD30阳性肿瘤位点的结合，进而影响药效。

本妥昔单抗BV是基于人源化CD30抗体AC10制备的ADC药物，在早期的前临床研究中研究人员证明了该药物的内化作用、与溶酶体的共定位以及较高的细胞毒性作用。此外，CD30被证实会发生网格蛋白介导的内吞作用，因为当细胞被多种类型的CME抑制剂处理时其内化被阻断，而细胞膜窝样内陷介导的内吞抑制剂对胞吞作用无影响。

ADC/CD22靶点内吞

CD22是140kD的跨膜糖蛋白，和CD33一样也是Siglec家族的成员，二者在结构上关键的区别在于CD22比CD33大得多，因为它有多个Ig结构域和ITIM基序。CD22的表达仅限于B细胞，且在各种B细胞恶性肿瘤(包括ALL)的大多数母细胞中表达水平升高。CD22通过CME途径进行内吞，且它不利用细胞膜窝样内陷介导的内吞，因为在该内吞途径抑制剂存在的情况下内吞率不会受到干扰。

B细胞含有大量的CD22胞内存储，这些CD22定位到细胞膜表面来补偿CD22的内在化行为。天然类配体通过CD22的组成型快速内在化作用在细胞内积累，这些配体在溶酶体中被分解而CD22又循环重新回到细胞膜表面。此外，CD22配体诱导的内吞作用激活细胞内储备从而补充或增加细胞膜表面的CD22表达水平。综上，CD22靶点对于ADC药物应该具有良好的内吞属性。

G544是奥加伊妥珠单抗InO的单抗部分，靶向位于N端结构域的A表位。最近报告了一例肿瘤细胞CD22低表达的患者(<正常水平的30%)，奥加伊妥珠单抗仍然显示出非常好的响应和生存获益。基于令人印象深刻的数据，即使InO被被回收到细胞表面，但CD22出色的内化活性弥补了这一局限性。

ADC/CD79b靶点内吞

特异性抗原结合是通过BCR的细胞表面免疫球蛋白部分发生的，但两个通过非共价关联的跨膜蛋白CD79a和CD79b介导了BCR胞内的信号转导和内吞作用，CD79a-CD79b异源二聚体是控制BCR内吞作用的支架。BCR的内吞主要是由AP-2介导的CME形式，CD79a直接与AP-2的μ亚基互作进而激活CD79b并导致整个BCR复合物的内化。如果CD79b的近端膜酪氨酸(Y195)发生突变，AP-2与CD79a的结合会被阻断，胞吞作用同样被阻断。

抗CD79b单克隆抗体SN8被证明可以结合并有效内化到淋巴瘤细胞中已经有30年的历史，并最终被转化成ADC药物PV。虽然从原理上讲CD79a也是非常有前景的ADC药物开发靶点，但是前临床研究发现抗CD79b的ADC药物明显比同样开发和测试的抗CD79a的ADC药物更有效，因为同样是在64ug/kg的剂量下仅有CD79b ADC药物可以消除肿瘤。在多种淋巴瘤细胞系的测试中发现37◦C孵育20分钟100% SN8单抗会快速内化，由此可见其作为ADC靶点的优越性。值得注意的是，多达25%的DLBCL激活的B细胞亚型中存在CD79b突变，这些CD79b突变可能会抑制内吞作用，特别是当突变发生在ITAM区域时。

总之，CD79b似乎是为ADC的作用机制量身定做的靶点，其精细的内吞作用以及随后转运到富含蛋白酶的溶酶体样结构是ADC有效传递有效载荷并产生有效细胞毒性的理想手段。鉴于CD79b在大多数DLBCL标本中高表达，这意味着大多数患者有可能对PV产生反应。

ADC/Trop2靶点内吞

Trop2是一种46 kD的单体糖蛋白，其肿瘤组织过度表达、组成性内吞作用以及向溶酶体转移等特性使其成为ADC领域一个极具吸引力的靶点。Trop2在细胞表面的过表达已经得到了充分的证明，在大约30种不同的肿瘤类型中都可以被鉴定出来，此外肿瘤细胞质中检测到的Trop2蛋白数量也与患者预后具有相关性。Trop2的内吞作用也被证明与CME有关，并且在前列腺癌模型中，研究人员观察到Trop2持续快速内吞作用。Trop2强大内吞作用的一个潜在解释可能是由于Trop2的聚类特性，对Trop2的构象动力学进行研究发现Trop2通过位于跨膜域的氨基酸“VVVVV”组成的相互作用段形成天然的同源二聚体，并且Trop2的二聚体可以通过其他细胞表面蛋白进一步将Trop2单体连接进而聚类引发内吞作用。

戈沙妥组单抗SG的靶向部分是经过人源化改造的RS7抗体。RS7抗体最初是从手术切除的人原发性肺鳞癌的杂交瘤中产生的，并被发现对多种肿瘤类型的细胞系都有反应。内化测试实验发现在与肿瘤细胞共培养70分钟后，大约50%的RS7被乳腺癌MDA-MB-468细胞内化，这个比例在肺腺癌Calu-3细胞中更高。此外，相关研究发现与Trop2受体表达水平相比，细胞内吞活性可能与增加肿瘤杀伤效果更有关。抗Trop2的单抗也有多种，其中某些表位似乎更有利于内吞。

ADC/BCMA靶点内吞

BCMA也被称为TNFR超家族成员17，分子量只有20.2 kD。BCMA在80-100%的多发性骨髓瘤细胞系中表达，其在多发性骨髓瘤细胞中被组成性激活并诱导生长和存活。关于BCMA利用的精确内吞途径的研究较少，研究发现BCMA的唾液酸化修饰可能是内吞的一种调节方式之一。TNFR家族成员TNFR1被证明利用凹陷蛋白介导的内吞途径。

BCMA被膜内蛋白酶γ-分泌酶组成性地从质膜脱落，这可能会影响BCMA靶向的ADC药物与肿瘤的结合，然而研究人员发现细胞表面和可溶性BCMA相对量最高的H929细胞系对研发中的ADC表现出最高的敏感性，这暗示BCMA细胞表面水平可能比可溶性BCMA浓度对疗效的影响更大。尽管BCMA内化的内吞机制尚不清楚，但是从相关研究可以推测出BCMA会经历有效的内化过程并且被分选到溶酶体。重要的是，BCMA的内吞作用似乎是ADC有效性的一个主要因素。

ADC/Nectin-4靶点内吞

免疫球蛋白样跨膜蛋白nectin家族包括nectin-1-4四个成员，其中nectin-4是一种66kD的I型跨膜蛋白，其主要作用是促进细胞与细胞的接触。Nectin-4作为ADC靶点很具有吸引力，因为研究表明它在多种肿瘤类型中均检测到过表达现象，同时在正常成体组织中几乎不表达。

由于缺乏天然配体或mAb/ADC与nectin-4复合物内吞的相关信息，因此研究人员试图从nectin-4介导内化的病原体角度来间接推断该靶点对ADC的内吞作用形式。Nectin-4是麻疹病毒的受体，研究发现麻疹病毒进入MCF7和HTB-20是通过大胞饮形式进行的，病毒进入需要PAK1，动力蛋白制剂Dynasore对病毒入侵没有影响，表达显性抑制小窝蛋白的细胞不会破坏病毒的内吞作用，细胞松弛素D破坏肌动蛋白丝会阻断胞吞作用，可增加晚期内体pH值的内体酸化抑制剂BFA1不影响病毒的内吞作用，基于这些间接研究，研究人员推测nectin-4可能存在大胞饮形式的内吞作用。

ADC/HER2靶点内吞

HER2是一个185 kD的跨膜糖蛋白，是EGFR家族的成员，HER2/neu基因的扩增是人类恶性肿瘤形成和转移的一个强驱动因素。目前基于HER2靶点有两款ADC药物获批上市，分别是T-DM1和T-DXT，二者均是以曲妥珠单抗作为靶向部分。这两款ADC药物已被批准用于既往接受曲妥珠单抗和化疗的HER2阳性转移乳腺癌患者，T-DXT被批准用于之前接受过T-DM1治疗的患者。

综合研究发现HER2靶点的内吞作用是非常复杂的，可能涉及多种内吞途径，但细胞膜窝样内陷介导的内吞途径似乎更常用。T-DM1的疗效依赖于癌细胞上HER2的表达水平，高表达HER2的患者(IHC评分为3+)比表达水平降低的患者表现出更好的响应率。对于HER2高表达的细胞，内化不良可能通过细胞表面过量的HER2来补偿，这意味着仍然有足够的受体被内化。对于低HER2表达的细胞，更好的内化可能弥补细胞表面HER2的减少，这也是提高ADC疗效的关键参数。

有趣的是，基于HER2靶点的ADC的药效还可以通过大幅降低其在酸性内体条件下与HER2的亲和力来提高，这一过程被称为“酸性转换”，即通过结合到HER2而内化的抗体可以受酸性内体环境影响而彼此分离，其中HER2重新回到细胞表面，而抗体被分选到溶酶体。因此帕妥珠单抗被认为是一种有非常有潜力的单抗，因为它对HER2的亲和力在pH7.4的环境下要比pH6.0的条件下强10倍。相比之下，曲妥珠单抗在pH范围6.0-7.4的环境下与HER2的亲和力基本不变。

总结

分析靶标受体的内吞作用和ADC的内化，可以极大地促进临床前开发、临床转化和患者治疗效果。显然，内吞作用的效率和随后到溶酶体的路线与ADC靶受体的过表达状态和其他相关参数(如PK)一样重要。大多数ADC研究会展示利用靶标受体内化过程的最低能力以证明ADC在肿瘤细胞内递送有效载荷概念的合理性，这足以证明内吞作用在ADC领域的重要地位以及研究价值。

参考文献：

Hammood M, Craig AW, Leyton JV. Impact of Endocytosis Mechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-Drug Conjugates (ADCs)-A Necessity for Future ADC Research and Development. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Jul 15;14(7):674. doi: 10.3390/ph14070674. PMID: 34358100; PMCID: PMC8308841.