Viruses：新基因测定法助力新冠药物大洗牌

众所周知，SARS-CoV-2的3C样蛋白酶（3CLpro），因其对病毒复制至关重要，并且具有不同于人蛋白酶的切割特异性而被认为是COVID-19抗病毒药物开发的绝佳靶标。但是，由于缺乏可在BSL-2（生物安全等级2级实验室）环境中进行的基于细胞的报告基因检测，阻碍了3CLpro的药物开发。

当前鉴定3CLpro抑制剂的工作主要依靠体外筛选，而这种筛选无法说明抑制剂的细胞渗透性和细胞毒性，或者涉及病毒复制的测定法必须在BSL-3实验室中进行。为了解决这一关键局限性问题，美国国家癌症研究所开发了一种新型的基于细胞的荧光素酶互补报告基因测定法：

1. 轻松地将真正的3CLpro抑制与细胞毒性区分开

2. 减少筛选过程中的假阳性（筛选到目前在研的新冠药物真实阳性率不足16%）

3. 在生物安全等级2级实验室2环境中鉴定或开发SARS-CoV-2 3CLpro抑制剂。

先说重点

基于细胞的荧光素酶互补报告基因测定方法以慢病毒载体为基础，共表达3CLpro和通过3CLpro切割位点连接在一起的两个荧光素酶片段。3CLpro介导的切割会导致互补作用的丧失和萤光素酶活性的降低，而抑制3CLpro会导致萤光素酶活性的水平提高10倍。萤光素酶报告基因检测可以轻松地将真正的3CLpro抑制与细胞毒性区分开，这种强大的功能可以减少筛选过程中的假阳性。使用该分析方法，科研人员筛选了32种针对SARS-CoV-2 3CLpro的小分子活性抑制剂，包括HIV蛋白酶抑制剂，HCV蛋白酶抑制剂和各种其他抑制SARS-CoV-2 3CLpro的化合物。其中，只有5种（GC376，boceprevir，Z-FA-FMK，钙蛋白酶抑制剂XII和GRL-0496）对细胞中的3CLpro表现出显著抑制作用，阳性率不足16%，表明目前在研的新冠药物的重复率或真实数据需要重新洗牌。不难看出，该测定法极大地促进了鉴定更有效的SARS-CoV-2 3CLpro抑制剂进程。

实验开展：

1. 新型NanoBiT载体系统

科研人员首选使用NanoBiT–一种由NanoLuc荧光素酶设计的互补报告基因。NanoBiT由两个蛋白质片段组成：大BiT（L，17.6 kDa）和小BiT（S，1.3 kDa）。当L和S片段非常接近时，它们可以彼此互补形成功能性萤光素酶蛋白;当两个片段不紧密接近时，它们不缔合，导致萤光素酶活性低。重要的是，该系统完全可逆。即将L和S片段与包含SARS-CoV-2 3CLpro nsp4-nsp5切割位点的连接子（TSAVLQ↓SGFRKM，箭头指示切割位点）连接起来。当表达3CLpro时，它会裂解连接子，导致两个NanoBiT片段解离，从而导致萤光素酶活性降低。相反，当3CLpro被抑制（例如通过小分子）或失活（例如通过其催化位点的突变）时，NanoBiT将保持完整，从而导致高荧光素酶活性。

为进一步分析表达和切割情况，科研人员将慢病毒载体转染到293T细胞中，然后加入DMSO（对照）或100μM GC376（SARS-CoV-2 3CLpro的小分子抑制剂）。通过荧光显微镜和流式细胞术检测表明，GFP与L和S融合后仍保持功能。在转染后30小时对收集的细胞裂解液进行免疫印迹分析表明，用GC376或C145A突变抑制3CLpro生物活性，导致3CLpro和报告基因的表达均增加。

其次，为了评估荧光素酶互补测定法是否反映了3CLpro介导的浓度依赖性抑制，科研人员用不同浓度（0.1至200 μM）的GC376处理转染了S-L-GFP慢病毒载体的细胞。通过蛋白质免疫印迹发现，在不存在GC376的情况下，只有15％的S-L-GFP报告分子保持未切割状态；在存在GC376的情况下观察到了3CLpro介导的裂解呈浓度依赖性抑制作用，抗GFP抗体检测到的最大有效浓度（EC₅₀）值为12.6 μM，抗L抗体检测到的最大有效浓度（EC₅₀）值为23.2 μM。这些数据进一步证实了荧光素酶互补测定法对检测SARS-CoV-2 3CLpro抑制作用的有效性。

2. 消除细胞毒性对3CLpro抑制的干扰

为了确定细胞毒性是否会影响此荧光素酶分析法，科研人员通过DNA拓扑异构酶II抑制剂和抗癌药阿霉素对用SL-GFP慢病毒载体转染的293T细胞中荧光素酶报道分子活性和细胞活力做了分析发现，阿霉素导致细胞活力呈浓度依赖性降低，其50％的细胞毒性浓度（CC₅₀）为3.7 μM。但是，阿霉素并未导致萤光素酶报道分子活性发生任何显著变化。这些结果清楚地表明，荧光素酶互补报告基因测定可以区分3CLpro抑制和细胞毒性。当筛选小分子针对3CLpro的活性时，这一功能有利于消除许多由细胞毒性化合物引起的假阳性。

3. 重复性验证

据报道，人类免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶抑制剂，特别是洛匹那韦和奈非那韦，可抑制SARS-CoV-2在细胞培养中的复制。但是同样有研究表明，即使在最大测试浓度（100 μM）下，HIV蛋白酶抑制剂也不会在体外阻断SARS-CoV-2 3CLpro。然而，在最近的一份报告中，由于细胞毒性，发现洛匹那韦和奈非那韦在细胞培养中具有明显的抗SARS-CoV-2活性是假阳性结果。为此，科研人员使用此荧光素酶互补报告基因检测方法，重新确定了9种FDA批准的HIV蛋白酶抑制剂（包括洛匹那韦和奈非那韦）对细胞中SARS-CoV-2 3CLpro活性的影响。通过三个独立实验的结果表明，没有一种HIV蛋白酶抑制剂可导致萤光素酶报道分子活性显着增强。取而代之的是，对于大多数抑制剂，在最高测试浓度（100μM）下荧光素酶活性有统计上的显着下降，这可能是由于细胞死亡和背景发光损失所致。这些结果与以前的体外试验结果一致，并表明HIV蛋白酶抑制剂可能在细胞培养中抑制SARS-CoV-2复制的原因是细胞毒性和/或脱靶作用。这些结果进一步表明，我们的荧光素酶互补检测可以轻松地区分3CLpro抑制作用和细胞毒性作用。

尽管在文献中已经报道了许多SARS-CoV-2 3CLpro抑制剂，但是由于诸如细胞通透性、细胞毒性和脱靶效应等问题，其抑制3CLpro在细胞中的能力尚不确定。为此，科研人员利用新开发的荧光素酶互补报告基因测定法，重新评估了22种化合物对SARS-CoV-2 3CLpro活性和细胞活力的影响。这些化合物包括五种丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶抑制剂，SARS-CoV 3CLpro抑制剂（GRL-0496），三种宿主细胞半胱氨酸蛋白酶抑制剂以及其他类别的化合物。这些化合物中的大多数已在体外抑制SARS-CoV-2 3CLpro，并可能在细胞培养物中抑制SARS-CoV-2病毒复制。

荧光素酶互补报告基因分析结果显示，以上22种文章中证明的“有效”抑制剂只有4种（boceprevir、Z-FA-FMK、钙蛋白酶抑制剂XII和GRL-0496）可明显抑制SARS-CoV-23CLpro。其中，boceprevir是FDA批准的HCV蛋白酶抑制剂，Z-FA-FMK最初是作为细胞半胱氨酸蛋白酶抑制剂开发的，GRL-0496最初是作为SARS-CoV 3CLpro的抑制剂开发的，但也发现它对SARS-CoV-2有活性。尽管据报道在体外抑制SARS-CoV-2 3CLpro，但在本次的测定中，其余化合物均无显著活性。对于这些化合物观察到的差异有几种可能的解释–较差的细胞通透性，缺乏特异性，替代的作用机制（即脱靶效应）和可能过度的细胞毒性。

总结

新型荧光素酶互补报告基因测定法，用于鉴定活细胞中的SARS-CoV-2 3CLpro抑制剂具有灵敏、快速、易于执行的优点，并且可以轻松地区分3CLpro抑制作用与细胞毒性作用，这种强大的功能可以消除筛选过程中的假阳性现象（在我们筛选到的共32种蛋白酶抑制剂中，仅有5种有效，重复率不足16%）。通过此方法，成功的鉴定了来自其他冠状病毒的3CLpro抑制剂对COVID-19的药用开发价值，加快鉴定更有效的3CLpro抑制剂进程。

参考文献：Viruses 2021, 13, 173. https://doi.org/10.3390/v13020173

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