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FDA审评官员对非酒精性脂肪肝动物模型的反思及对开发者的提醒
五一假期，读了一些FDA对以实验动物为中心的现行转化医学模式的材料，以及FDA在推动以器官芯片、类器官和体外3D技术为核心的新转化医学方面所作的努力，深有感触。前文（人与模式动物的免疫差异导致FDA加快推进“去动物化”进程）从免疫差异的角度，评价模式动物在评估以免疫治疗为代表的免疫相关产品的无能为力。本文则从一个具体的疾病模型展开，探讨FDA对非酒精性脂肪肝（即NASH）动物模型的批判性思考。事实上，随着奥贝胆酸NDA过程中的波折，武田、先灵葆雅等NASH相关药物开发机构越来越多转向采用基于肝器官芯片模型寻找临床终点、验证作用机制、推进产品申报。
本文由两部分组成：第一部分简要介绍FDA公布的基于杂交小鼠（collaborative cross mice）建立的NASH模型的不可靠；第二部分则是FDA认为的关于NASH动物模型的十个误区。
2020年初，FDA在国际肝病大会上报告了该机构自主发起的一项研究，旨在提醒非酒精性脂肪肝小鼠模型对NASH相关药物的开发带来的误导。这个宏大的研究计划由FDA下辖的国家毒性研究中心（National Center for Toxicological Research）联合德州农工大学的相关团队一起完成。
由于FDA在考察大量NASH药物申报材料时发现，极少有机构探讨非酒精性脂肪肝形成过程中的个体差异和性别差异。因而，该研究考察了25个品系的杂交小鼠，这些小鼠经过12周持续的高脂高糖（high-fat and high-sucrose, HF/HS）饮食诱导后，形成的非酒精性脂肪肝小鼠模型。并且同步考察在形成非酒精性脂肪肝过程中，不同小鼠之间的个体差异和性别差异。
该研究的主要结论概述如下：在不同品系和性别中的小鼠中都有不同严重程度的肝脂肪化现象，整体上雄性小鼠的脂肪化程度高于雌性小鼠——1，68%的雄性小鼠体内可以看到显著的肝脂肪堆积，而按照同样的检测标准，58%的雌性小鼠体内能观测到这一现象。2，在不同品系中的小鼠，肝脂肪化的程度是不一样的——雄性小鼠平均的脂肪化率是66%，不同品系中的脂肪化率差别甚大从3%到69%；而雌性小鼠的平均脂肪化率是27%，不同品系中的差异也很大从4%到31%。
该研究同时考察了NASH血清诊断的生物标记物，包括：总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、磷脂质和葡萄糖水平。NASH在小鼠体内形成的过程中也观测到了Pparg, Mogat1, Cd36, Acaab1, Fabp2, 和Gdf15的高表达，以及脂肪酸摄取和脂肪形成基因的重启。在雄性小鼠中，Pparg，Mogat1和Cd36与肝脏中三酸甘油三酯的形成高度正相关；而在雌雄小鼠中，Mogat1和Cd36与甘油三酯的形成正相关。
这个研究是FDA站在监管者的角度对NASH小鼠模型做的系统性评估，提醒NASH药物开发者重视并批判性接受HF/HS诱导的基因改造的小鼠模型。
第二部分：非酒精性脂肪肝动物模型的十个误区及规避方法
FDA和相关研究人员对NASH动物模型的使用提出十个误区，并鼓励采用更接近人体生理复杂度和相关性的人源化体外模型用以取代实验动物。以下是FDA技术交流会的简要记录，报告者是杜克大学肝病中心的Anna M. Diehl教授，他也是常年为FDA提供咨询和服务的科学家。
尽管在考察NASH药物的过程中，动物模型有不可否认的价值，但同时必须认识到，模式动物建构的NASH模型与人的生理特征有不容忽视的差异性——由于天然食谱的不同，高脂高糖饮食对动物的影响，在绝大多数时候，跟人是不一样的。在很多时候，采用具有人体生理复杂度和相关度的体外模型是十分必要且有价值的。跟动物模型相比，体外方案还为明确且独立地关注疾病的具体机制提供了系统考察的机会。
目前FDA已经接受了数十种产品依据体外疾病模型提供的机制数据。这些评估方案大都采用将人来源的肝细胞与自由脂肪酸（free fatty acids, FFAs）共培养；同时，还可以将实质细胞与非实质细胞共培养，研究星状细胞和纤维化基因的激活。3D肝模型常用的有微球形状的，也可以是三明治形状的（spheroid cultures or sandwich cultures），无论采取哪种培养方式都不能忽略对细胞-细胞、细胞-间质相互作用的考察，并维持必须要的肝功能。FDA在实践中，还有公司直接采用肝组织芯片（precision cut liver slices）用于机制的验证。在进行相关数据评估时，FDA重点考察这些体外方法的3D多细胞结构以及动态微环境。
FDA认为，体外3D肝模型为系统性替代模式动物提供了可行的方案，并且可以用于药物安全性和毒性的评估——但必须建立在临床转化证据的基础上。例如，FDA正在与几家器官芯片公司（子瞻生物是其中一家）进行深度的合作，微流控肝器官芯片，可以实现肝实质细胞、星状细胞、kuffer细胞与内皮细胞的共培养，并将脂肪酸、葡萄糖、炎症因子等通过灌流系统长期影响微肝器官，同时兼容转录组学、细胞信号传导、病理生理变化等多种检测，为NASH药物的全面评估提供可能。
值得一提的是，奥贝胆酸正在与包括子瞻生物在内的四家肝器官芯片系统服务商合作，进行抗脂肪变性、抗炎症和抗纤维化作用的评估和筛选，为项目的继续推进提供新的数据支持。
误区二：期望用一个单一的模型来概括NASH的所有特征
FDA直言，当下没有一个模式动物可以用于概括人非酒精性脂肪肝的所有特征。因此，研究人员应该根据自己产品的特性，关注NASH疾病的特定方面，选择并建立合适的模型。
FDA承认，最有意义的疾病模型是不仅能够反应NASH的病理特征，更能反应NASH引发的系统性的代谢紊乱——这意味着需要同步表现出肝脂肪变性、小叶内炎症、肝细胞球囊化和窦周纤维化；此外，还应该表现出肥胖、体脂分布异常、胰岛素抗性、血糖异常、血脂异常和脂肪因子改变等多种指标。但这些特征是难以同时出现的。
因此，FDA鼓励研究者采用多种模型，包括动物模型和人源化体外模型，从不同面向阐述机制。
通过HF/HS饮食诱导的动物模型是目前NASH疾病模型的主流，有相当多的研究者完全忽略了遗传因素对动物的影响。FDA认为，遗传因素对NASH的形成和发展至关重要——例如：有研究者采用T细胞敲除的小鼠论证NASH在肝癌行程中的作用，但经过T细胞缺乏的小鼠对肿瘤生成的解释是扭曲的；不仅如此，还有研究者采用经过基因编辑的小鼠阐明NASH的发病机制，也是很令人担忧的。
尽管如此，大多数基因编辑的NASH小鼠模型都包含患者中不常见的基因突变。在这种情况下，动物模型的价值在于能够研究参与代谢稳态的孤立通路，以及由此产生的后果。
大多数的NASH动物模型都需要相当长的时间才能有相应的症状出现，主要原因是NASH与长期的高脂高糖饮食相关。通常情况下，至少需要4个月的HF/HS饮食，小鼠才会出现不同程度的脂肪变性，无论有没有明显的炎症出现。此外，如果要看到纤维化，则需要更长的时间。最后，如果研究者期望重现自然病程，则至少需要12个月才能发展到肝癌HCC。
不仅如此，NASH疾病谱的极端多样性意味着NASH的动物模型本身也是可变的，而且组织病理学特征也很难出现稳定的状态。例如，在大多数的动物模型中，从普通的NASH发展到肝癌HCC的病程中，新生肿瘤结节的数量、大小和恶性程度都是难以预测的。
在已发表的大量文献中，NASH动物模型的饮食组成具有很大的差异：脂肪来源有猪油、黄油、椰子油、橄榄油、玉米油、大豆油等不同的脂肪来源，这些来源不同的脂肪在脂肪酸方面有不同的组成。在经过动物体内的代谢过程后，动物肝脏中的脂质累积是不均一的。不仅如此，饮食中包含的脂肪量也没有办法标准化，这种差异也会体现在NASH小鼠模型的建构过程中。
不同品系小鼠的遗传背景对NASH严重程度影响绝大。尽管目前大多数的NASH小鼠模型依赖于C57BL/6小鼠，但重要的是，必须认知到其他品系对NASH敏感度的差异。因此，对小鼠品系的选择至关重要。（见第一部分）
C57BL/6J小鼠比C57BL/6N小鼠更具有胰岛素抗性。据报道，据报道，来自Jackson实验室的C57BL/6J小鼠可能携带一种烟酰胺核苷酸转脱氢酶基因(NNT)的自发突变，这种突变可以影响线粒体功能，从而影响NASH的发展，但来自其他供应商的C57BL/6J小鼠和C57BL/6N小鼠均不存在这一现象。
不同性别的动物在NASH易感性和严重程度方面表现出巨大的差异。与人类似，雄性啮齿类动物似乎比雌性更容易发生NASH。FDA的审评员发现，绝大部分的研究只选择使用雄性动物，这是一个有趣的现象。
在不同饮食诱导的NASH模型中，雄性动物比雌性更容易表现出明显的脂肪变性、血清丙氨酸转氨酶、胆固醇、瘦素水平增高等现象。
即便如此，FDA也要求不能忽略对雌性动物特定的病理生理分子和细胞机制的研究，这些因素和研究对NASH的精准治疗方案意义重大。
动物模型中NASH的产生机制还有很多不清楚的地方，除了动物模型对模拟NASH这样多因素复杂疾病的适用性外，对发病机制的理解是至关重要的。
FDA鼓励利用多组学技术对人和动物模型从临床表型、基因组异质性、转录组学、代谢组学等多角度，就某一个特定的科学问题或测试某一个特定药物，进行系统的评估。
有证据表明，不同动物模型的基因表达谱会有不同程度的重叠。但总的来说，与其他模型相比，高脂高糖诱导的小鼠肝脏中的基因表达模式更接近于人体，但差异也是很大的。
FDA的审评员很难看到不利于产品和疾病模型的数据。根据FDA的相关要求，在申报产品时，动物品系、遗传保真度等相关的细节数据是需要报告的。但现实中，这类数据往往缺乏。
考虑到NASH的复杂病因和病理，缺乏通用标准建立的单一动物模型（每个动物模型都有其优点和缺点），很可能遇到假阳性、假阴性，以及不确定的数据。FDA深知，尽管这类数据缺乏，但不代表没有没有重要的发现。这些所谓“不利于产品”的数据，对FDA确立新的原则和规则至关重要。
由于临床前动物研究的特殊性，在解释相关数据时，异常结果往往被研究者忽视，尽管这些数据在理论上应该被报告。
为了避免潜在的偏差，应该预先定义合格和排除标准，并以盲法和随机方式进行实验。与设计合理的研究相比，如果不这样做，达到具有统计学意义的结果的几率就会增加3倍以上。特别是对于正态分布的数据和大样本容量的数据，大约每22个观察中就有1个离均值的标准差相差2倍或更多。无论何种情况，都应该仔细检查异常值，以确定它们是否确实反映了NAFLD病理(或治疗)的最终光谱，还是实验中人为因素的结果此外，以有针对性的方式排除离群值(即考虑它是否支持预期结果)，可能会对假阳性和扭曲的解释产生极端的后果。
最后强调一点，研究中被放弃的动物数据也应该要报告。在临床研究中，报告标准，如报告试验统一标准(CONSORT)和加强流行病学观察性研究报告(STROBE)指南，要求报告给定临床试验中的所有退出病例。相比之下，许多动物研究没有报告这个数字。如果加上有针对性的异常值排除，结果可能是显著的四倍，一种治疗的有效性被夸大了近200倍。研究人员所使用的NASH动物模型中，异常值不应被忽视。离群值可以提供关于模型的内在特征的关键信息，或者在药物开发中，提供被研究药物的内在特征。
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