黑马 | 又一家中国PROTAC研发公司浮出水面

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近日，在欧洲药物化学杂志上，一家中国PROTAC研发公司：苏州德亘生物医药有限公司发表了其最新研究成果。他们设计并合成了一系列靶向降解AR（雄激素受体）的PROTACs分子，实验结果显示其在体外可降解VCaP（前列腺癌）细胞中的AR，最优化合物A031的IC50=0.25μM。该化合物还能显著抑制斑马鱼体内VCap细胞的生长，与EZLA（恩杂鲁胺）相比，毒性只有其五分之一。大鼠实验观察到其具有合理的半衰期和清除率，展示了该PROTAC具有成药的潜力。

苏州德亘生物医药有限公司成立于2018年，是一家专业从事PROTAC新药开发的创新型企业，创始人兼CEO郁光亮毕业于兰州大学，曾就职于江苏恒瑞制药，是最早一批入职恒瑞的药物合成化学家。

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一

摘要

在过去几十年中，前列腺癌是引起病人死亡的十大癌症之一。AR受体在前列腺癌的信号传导中起着非常重要的作用，目前晚期前列腺癌的一线疗法是雄激素剥夺治疗（ADT）。研究发现大部分患者在用药过程中其AR的配体结构域发生了变化，使得原来行使拮抗剂功能的EZLA等化合物（图1）变为激动剂，逐渐产生了耐药性。然而研究表明大多数患者肿瘤中的AR蛋白仍旧持续高表达，因此AR仍旧是待研究的可靠靶点。

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图1AR拮抗剂的化学结构

传统小分子抗癌药在抑制AR的活性的同时会使突变的靶蛋白高表达，使机体产生耐药性。2002年Akamoto提出了PROTAC的概念，这类化合物可以将胞内的蛋白靶向SKPI-Cullin-F-box复合物中降解，该团队后续进行了很多相关研究，为这类化合物的开发奠定了基础。在开发早期，PROTAC的透膜率很低，Schneekloth用细胞内源性缺氧诱导因子（HIF1α）的7个氨基酸序列取代了磷酸肽部分，该设计很大程度上提高了PROTAC的透膜率。2008年，Schneekloth用Nutlin作为MDM2的配体，合成了第一个小分子PROTAC，该化合物具有更好的透膜性但是活性不如之前的大分子PROTAC。2012年，Buckley合成了靶向VHL E3连接酶的PROTAC并在2015年取得了重大突破。现今，小分子的PROTAC的队伍飞速壮大。Neklesa合成了第一个进入临床的ARPROTAC ARV-110，在小鼠体内它比EZLA具有更有高的肿瘤抑制率。在PROTAC从多肽开发至小分子的过程中，研究者共鉴定了小分子可以结合的连接酶配体的四种结合蛋白，分别为MDM2、clAP、VHL，CRBN。小分子PROTAC一般由三部分组成：E3连接酶结合部分、连接链、目标蛋白结合部分。它可以招募E3泛素化酶与靶蛋白进行结合，靶蛋白在泛素化后被蛋白酶体降解。和传统小分子化合物相比，PROTAC提高了靶蛋白的清除效率和治疗效果。

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图2AR拮抗剂及VHL配体的结构

本文共使用了两种AR拮抗剂和四种E3连接酶的结合物，排列组合合成了多个AR PROTAC化合物（图2）。结果表明，A031是其中最优的化合物，它在AR表达阳性的前列腺癌细胞VCap中的IC50值为0.25μM。本文使用斑马鱼对A031进行了动物最小毒性浓度（MTC）和异种移植肿瘤的抑制率的测定，同时也在SD大鼠上测定了A031的药代动力学参数（PK）。

二

结果与讨论

2.1 降解AR的PROTAC的设计与合成

本文设计药物分子的目的是为了找到比已有的PROTAC更低毒、活性更强的化合物。关于AR拮抗剂部分，Guo报道了一种AR蛋白和其抑制剂的共晶结构。为了得到更好的化合物与AR和VHL或CRBN的结合活性，本文用四氢萘环和八氢戊烯取代了原来的四元环，并且使用了不同的连接子连接两个部分。VHL/CRBN配体部分，本文设计参考了化合物ARV-766和ARV-771，并在此基础上探索了化合物上与CRBN结合的部分结构上的取代基的位置对活性的影响。

A001-A032的合成路径见Scheme 1。α-去甲基托品醇先用Boc2O保护得到4，4和2-氯-4-氟苯乙腈在氢化钠的条件下生成5，5在酸性条件下脱Boc后以高收率得到6，6和7一起在偶联剂HATU的催化下生成化合物8。酯10经过脱Boc后在325W的微波条件下与9进行SN2取代反应后得到关键的酯类化合物11，随后11在酸性条件下水解得12，12最后和VHL配体13在HATU和DIPEA存在的条件下得到最终产物A031。

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方案1A001-A032的合成路径

2.2 降解AR的PROTAC的相关评价

本研究利用有效的AR拮抗剂、CRBN配体或VHL 配体，已设计并合成了一系列潜在的PROTAC AR 降解剂。在不同浓度呈AR阳性的VCaP细胞中测试了所有这些已合成化合物的细胞抑制作用，结果测得A001 – A004的抑制率分别为0.032μM、0.16μM、0.8μM、4μM，A005 – A009的抑制率分别为0.125μM、0.25μM、0.5μM和1.0μM，结果详见表1和表2。结果表明，这些化合物具有剂量依赖性，且连接子的长度会影响细胞抑制作用。A005在1.0μM下可抑制50.44%的细胞活性。

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化合物	Linker	%VCaP细胞抑制作用
化合物	Linker	0.032μM	0.160μM	0.800μM	4.000μM
A001		–	–	21.88	30.58
A002		15.4	27.68	42.53	42.08
A003		0.07	22.09	41.48	51.23
A004		–	15.71	42.39	47.17

表1A001-A004对VCaP细胞抑制作用的研究

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化合物	Linker	%VCaP细胞抑制作用
化合物	Linker	0.125μM	0.250μM	0.500μM	1.000μM
A005		19.01	29.03	44.35	50.44
A006		–	–	9.74	30.44
A007		19.99	24.65	30.06	36.92
A008		10.12	23.52	32.15	40.50
A009		26.29	27.41	28.30	37.49

表2A005-A009对VCaP细胞抑制作用的研究

通过替换连接子在CRBN配体上的取代位置，合成A010 – A015，并分别在浓度为0.125μM、0.25μM、0.5μM、1.0μM检测。结果详见表3，其与表1/2相比并无太大差异。基于上述结果，以CRBN E3配体和托品醇为基础的AR拮抗剂，可能不是用于开发有效AR降解剂的合适体系。

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化合物	Linker	%VCaP细胞抑制作用
化合物	Linker	0.125μM	0.250μM	0.500μM	1.000μM
A010		31.70	36.28	37.82	38.85
A011		20.39	31.37	34.22	34.92
A012		10.25	22.24	36.47	53.10
A013		17.15	25.61	30.06	42.39
A014		28.10	30.72	35.20	30.39
A015		14.91	23.30	30.07	34.04

表3A010-A015对VCaP细胞抑制作用的研究

根据前述结果，本文转而制备了另一种AR拮抗剂，通过类似A001的合成路线顺利的获得了A016 – A020，然后分别在0.125μM、0.25μM、0.5μM、1.0μM浓度下测试其对细胞的抑制作用（表4）。不幸的是，与A005 – A009相比，所有这些化合物的抑制率都降低了。研究结果表明，AR-2的亲和力可能比AR-1的弱。

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化合物	Linker	%VCaP细胞抑制作用
化合物	Linker	0.125μM	0.250μM	0.500μM	1.000μM
A016		6.05	19.47	24.56	26.02
A017		–	18.01	24.29	25.02
A018		24.10	30.27	38.13	44.53
A019		30.66	31.84	34.47	35.28
A020		7.46	14.03	14.30	14.84

表4A016-A020对VCaP细胞抑制作用的研究

本研究以A002为模板，通过保留AR拮抗剂的部分并以VHL-1替换CRBN配体得到A021 – A023（图2），在浓度为0.125μM、0.25μM、0.5μM、1.0μM下不断测试其抑制率（表5）。结果显示，当连接子缩短时其抑制率随之下降，虽然活性比A016略高，但与A009相比仍无明显改善。

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化合物	Linker	%VCaP细胞抑制作用
化合物	Linker	0.125μM	0.250μM	0.500μM	1.000μM
A021		5.34	15.94	29.03	55.25
A022		–	11.31	24.08	44.69
A023		–	2.18	14.49	29.8

表5A021-A023对VCaP细胞抑制作用的研究

受Wang的启发，本文用VHL-2（图2）替换了VHL，并缩短碳链从而得到A024 – A026（表6）。令人高兴的是，所有抑制率均高于A001，尤其是A025，在1.0μM浓度下其抑制率高达86.67%。结果表明，AR降解物与VHL配体的紧密结合对细胞的抑制是非常必要的。

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化合物	Linker	%VCaP细胞抑制作用
化合物	Linker	0.125μM	0.250μM	0.500μM	1.000μM
A024		18.54	31.13	56.59	64.56
A025		–	5.65	35.15	86.67
A026		1.87	2.74	18.19	61.19

表6A024-A026对VCaP细胞抑制作用的研究

Rainaet al.报道了在VHL配体中加入一个（S）-甲基可显著提高与E3配体的亲和力。因此，本研究使用VHL-3 E3配体合成A027–A032，并在浓度0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1.0μM下测试（表7）。1.0μM浓度下，A028、A029、A030和A031在VCaP细胞系中的抑制率分别显著的增加到76.15%、72.51%、72.33%、69.56，这表明A028-A031是高效的AR降解剂。A031甚至在浓度0.0625μM下也表现出良好的抑制效果。因此，本文选择A031做进一步的生物学评价实验。

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化合物	Linker	%VCaP细胞抑制作用
化合物	Linker	0.125μM	0.250μM	0.500μM	1.000μM
A027		–	6.65	12.54	28.07
A028		44.95	61.82	70.64	76.15
A029		28.39	57.23	63.64	72.51
A030		42.40	52.04	61.46	72.33
A031		40.28	56.41	66.10	69.56
A032		18.84	25.60	33.85	43.25

表7A027-A032对VCaP细胞抑制作用的研究

在2.0μM的VCaP细胞中，本文使用Western blotting检测了A031降解AR的动力学。结果显示，A031在2小时内有效降低了AR蛋白水平，4.5小时后AR蛋白几乎全部降解，这说明A031能够快速降解VCaP细胞中的AR蛋白（图3）。

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图3 CaP细胞中的AR蛋白经A031处理后的Western blotting分析，以α-微管蛋白为对照

为了进一步研究A031在VCaP细胞中的作用机制，本文进行了机理研究，结果如图4所示。结果表明，用蛋白酶体抑制剂（MG132）和NEDD8-激活E1酶抑制剂（MLN4924）预处理VCaP细胞2小时，能有效阻断A031诱导蛋白降解的能力。对于VHL-3来说，A031可以在10μM浓度下竞争性识别E3连接酶，然而A031仍然具有很强的诱导AR蛋白降解的能力，因此研究数据表明A031是一个真正的AR降解剂。

图4以α-微管蛋白为对照，A031诱导VCaP细胞中AR降解的机理研究

2.3 A031对异种移植瘤的生长抑制率和毒性的评价

将VCaP细胞用CM-DII荧光染料标记，并移植到斑马鱼模型中，分别用浓度为2.8μM、8.3μM、25μM的A031溶液处理斑马鱼，同时选用浓度为5μM的恩杂鲁胺（EZLA）作为阳性对照组（表8，图5）。经EZLA处理后斑马鱼中VCaP的荧光强度为268,811像素，与正常组相比，肿瘤生长抑制率为49%。用浓度为2.8μM、8.3μM、25μM的A031处理过的斑马鱼，其VCaP的荧光强度分别为379577像素、240013像素、208489像素（图4d，4e），肿瘤生长抑制率则分别为28%、55%、61%。如上所述，A031和EZLA具有相似的功效。因此，A031对斑马鱼中VCaP的生长有明显的抑制作用。

分组	浓度（μM）	荧光强度（像素，均值±SE）	抑制率
正常组	–	530692±20809	–
EZLA	5	268811±19075	49%
A031	2.8	379577±18686	28%
A031	8.3	240013±17518	55%
A031	25	208489±11535	61%

表8A031和EZLA对斑马鱼中VCaP的抑制作用（n = 10）

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图5 用A031和EZLA处理后斑马鱼中VCaP的荧光强度

接下来，本文用野生AB型斑马鱼作为动物模型，分别给予浓度为6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM的A031水溶液和浓度为5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM的EZLA水溶液并采用最小毒性浓度（MTC）评价A031的毒性（表9）。25μM浓度下，A031无沉淀，也未诱导斑马鱼的死亡或毒性表型，说明A031对斑马鱼的最小毒性浓度为25μM。同时，约10%的斑马鱼在5μM的EZLA处理下侧翻，说明EZLA的最小毒性浓度约为5μM。结果表明，A031的毒性比EZLA小5倍。

分组	浓度（μM）	死亡数量（尾）	死亡率（%）	毒性表型
正常组	–	0	0	正常
A031	6.25	0	0	正常
A031	12.5	0	0	正常
A031	25	0	0	正常
A031	50	–	–	明显沉淀
A031	100	–	–	明显沉淀
EZLA	5	0	0	10%侧翻
EZLA	10	30	100
EZLA	25	30	100
EZLA	50	30	100
EZLA	100	30	100
EZLA	200	30	100

表9A031和EZLA处理过的野生AB型斑马鱼（n = 30）的浓度与致死量之间的关系

2.4 A031的药代动力学（PK）的研究

接下来本文研究了雄性SD大鼠中A031的ADME过程（吸收、分布、代谢，排泄）。将A031溶解于5%的DMSO和85%的饱和氯化钠的混合液中，实验组编号为901、902，903的三只大鼠以0.2mg/kg的剂量静脉注射A031，注射后分别在0.0333h、0.0833h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h和8h这七个时间点对大鼠进行静脉采血，所得数据经过软件WinNonlin8.2和Origin8.0的处理和计算，得到各PK参数和药物浓度曲线（图6，Table10）。理论上较短的半衰期意味着药物代谢很快从而导致药效低下，然而过长的半衰期也意味着药物会在体内蓄积并且可能导致较高的毒性反应。从数据上看，A031具有适中的半衰期和清除率，同时其Cmax相对较大也表明了其血药浓度较高，令人惊讶的是血浆中A031的浓度在8h时呈上升趋势。我们猜测可能与A031的溶解度低有关，血液中药物的溶解度低注射后部分药物析出，待溶解的药物被机体清除后原来不溶的药物逐渐溶解于血液，从而造成了一段时间后血药浓度的上升。

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图6 雄性SD大鼠单次静脉注射量为1mg/kg的A031后的血药浓度（ng/mL）

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表10 A031在雄性SD大鼠体内的药代动力学（PK）参数

三

总结

本研究优化了与AR拮抗剂和E3连接酶配体连接的化学连接子并且使用了两种AR拮抗剂、一种CRBN的配体和三种VHL配体，合成了一系列的AR PROTAC并最终筛选出A031为最优结构。研究表明A031在体内外均能抑制VCaP细胞的增殖，体外实验表明它在1μM时的细胞抑制率为69.56%。此外，A031降解AR具有时间上的相关性，WB实验表明在VCaP细胞中，2μM的A031 4.5h几乎能降解全部AR。另外本文还研究了蛋白酶抑制剂MG132，泛素化酶抑制剂MLN4924，VHL配体的加入对A031蛋白降解能力的影响。同时，体内实验表明8.3μM的A031对斑马鱼中异种移植的肿瘤细胞的抑制率为55%，其抑制能力与恩杂鲁胺相似。A031最小毒性浓度为25μM，其毒性是EZLA毒性的五分之一。SD大鼠的药动学实验也表明A031具有良好的半衰期和清除率。总之，以上研究结果表明A031是降解AR的有效PROTAC。

参考文献

https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2021.113307