2020诺奖得主助力新冠研究，CRISPR技术揭示冠状病毒共同弱点！

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作者 | 刹那小公子

洛克菲勒大学的Charles M. Rice因为其对HCV的卓越研究，获得了2020年诺贝尔生理学和医学奖。其实验室不仅长期致力于HCV的研究，其对各种突发性病毒传染病也非常关注，比如寨卡病毒（Cell，2017）和近期肆虐的新冠病毒。

近日，Rice团队利用CRISPAR技术，分析了宿主蛋白对冠状病毒感染和复制的影响，为寻找冠状病毒通用治疗靶点提供了实验依据。该文章发表于最新一期的Cell子刊Cell Host&Microbe。

1.通过CRPSPAR-Cas9进行正向遗传学筛选寻找潜在靶点

针对新冠病毒的药物，一方面可以特异性的针对该病毒的毒力因子，例如N蛋白和ORF3a蛋白；同时，病毒作为寄生生物，其生命周期依赖于宿主细胞，因而其需要劫持并利用宿主细胞，完成自身复制和持续侵染。Rice团队从该角度出发，为了寻找潜在的依赖性宿主蛋白，该团队依托26种新冠蛋白与人类宿主蛋白的作用图谱（Nature，2020），针对332个目的蛋白，设计了sgRNA文库，并利用CRISPAR-Cas9正向遗传学筛选的方式，来验证其是否参与新冠病毒的感染和复制。

其基本原理是，利用慢病毒载体表达针对332种基因的sgRNA（每个基因10对sgRNA，共3320个），312个安全的阴性对照（针对非基因区域）和310种阳性对照（针对细胞生存和增殖的必要基因）。转染后筛选出sgRNA阳性细胞，并用新冠病毒感染这群细胞，然后提取DNA进行测序。该系统采用的是Huh-7.5细胞，该细胞被新冠病毒感染后会迅速发生死亡。培养温度为33度和37度，分别是上呼吸道和下呼吸道的温度。

理论上，新冠病毒依赖的宿主基因被敲掉后，病毒对该细胞的感染势必减弱，因而这群细胞会成为主要细胞群；而新冠病毒不依赖的基因被敲掉后，其感染不会发生变化，细胞会迅速死亡，因而该细胞群会相对弱势并最终消失。因而，从测序结果种就可以分辨出，332个目的蛋白是否参与病毒的感染。

2.验证潜在靶点

基于CRPSPAR-Cas9进行正向遗传学筛选结果证明，VSP11，Rab10等参与内吞体和溶酶体功能的蛋白，对于新冠病毒的感染至关重要。为了进一步验证测序所得到的结果，Rice团队利用Huh7.7和A549细胞重复了上述实验，通过siRNA敲低VSP11等基因，检测手段换为免疫荧光检测新冠病毒N蛋白。可以看到，23个潜在靶点，大部分确实参与了新冠病毒的感染。

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3.冠状病毒家族对宿主蛋白以来的共性和异性

我们知道，来源于同一家族的病毒，其进化上具有相关性，在致病机制上具有一定的相似性。其对宿主蛋白的依赖，不仅具有特异性，也具有共性。为了更近一步的研究冠状病毒和宿主的相互作用机制，以及寻找针对该病毒类群的共同靶点，Rice团队使用另外三种人类冠状病毒，即HCoV-229E, HCoV-NL63, 和HCoV-OC43，分别重复了筛选，并于新冠病毒的结果进行比较。该团队发现，四种病毒均强烈的依赖于Rabs和HOPS相关蛋白，而新冠病毒则高度特异性的依赖于胆固醇稳态相关蛋白。

总结该研究系统的阐释了四种不同的冠状病毒与宿主蛋白的关系，解释了溶酶体通路，胆固醇代谢通路是新冠病毒重要的作用位点。对于我们针对特异性靶点开发治疗药物和治疗方案，具有重要的指导意义。一方面，治疗位点可以作用于宿主蛋白；另一方面，治疗位点也也可以作用劫持该宿主蛋白的病毒毒力蛋白。

参考链接：https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S1931-3128%2820%2930671-5