天然产物来源变构调节剂的药物研发展望

以PTP1B为代表的蛋白酪氨酸磷酸酶家族(PTPases)在多种通路的调控中起着重要作用。尽管PTPases种类众多，但其活性位点高度保守。因此，研制具有选择性的PTPases抑制剂具有重要的临床意义。近年来，随着蛋白质磷酸酶的天然变构抑制剂的报道，科学家们对PTPase药物的研发燃起了新的希望。大多数已报道的天然变构PTPase抑制剂的IC50值在低至亚微摩尔范围内，是最有效的PTPase抑制剂之一。目前发现的天然产物作用的PTPases变构口袋主要有三个，它们分别位于：1) 外位点(exosite)；2) C端无序非催化域；以及3) 催化位点附近的变构位点(如下图)。虽然在这些例子中，这些变构小分子和它们作用位点不同，但它们具有类似的作用机制：PTPase中负责催化的WPD区域是非常柔性的，至少存在两种构象态。开放构象与非活性构象有关，而封闭构象对PTPase的催化活性是至关重要的，该构象在与底物结合后趋向稳定。上述的变构抑制剂稳定了WPD的开放构象，使得PTP1B处于非活性状态。

Trodusquemine是这种作用机制的代表性化合物。该化合物在2000年被报道，随后的表型研究表明，该化合物具有广泛而显著的药理活性。进一步的研究表明，PTP1B是该化合物的主要作用靶标。随后的研究表明，PTP1B与trodusquemine的相互作用发生在两个不同的变构位点，它们通过正协同作用相互影响，Kd分别为0.3μM和1μM。Trodusquemine可与PTP1B的第一个位点结合可引起C端无序延伸区域的构象变化，而位于α-螺旋9′上的PTP1B残基在该结合中发挥了重要作用。Krishnan等人的研究表明，trodusquemine可通过与由α螺旋7和9形成第一个位点结合，进而引起α螺旋7、3、6的构象变化，形成第二个结合口袋——该口袋与外位点(exosite)部分重叠，最终影响PTP1B的WPD loop区，使得该蛋白处于非活化构象中(如上图)。在这个过程中，化合物与C端(即第一个结合位点)的结合是至关重要的。目前，trodusquemine已通过了I期和Ib期临床试验，而II期临床试验主要是针对糖尿病、肥胖等适应症。

Trodusquemine的例子很好的说明了天然产物是如何为药物研发领域带来新思路的。在这个例子中，PTP1B作为一个已研究超过20年的“老靶点”，仍然缺乏具有选择性和细胞通透性抑制剂。通过天然产物化学与化学生物学、结构生物学等多学科合作，发现了PTP1B的全新的作用位点。利用复杂的、由配体诱导的构象变化，使蛋白稳定在非活性状态下，进而发挥抑制作用。

蛋白酶是维持细胞稳态的关键酶，与多种疾病相关。蛋白酶具有共同的活性位点，因此很难有选择性地靶向蛋白酶。目前，大多数蛋白酶抑制剂都是非选择性竞争抑制剂，具有明显的副作用。20S蛋白酶体是一种约700kDa的多蛋白水解复合物，是一种N端水解酶，负责细胞内蛋白质的非酶体降解。目前已有硼替佐米、卡菲佐米和伊沙佐米三种蛋白酶体抑制剂上市，它们都是具有高度亲电活性的多肽。然而，上述药物的毒副作用较大，且对实体瘤的渗透性较差，制约了这些药物的临床应用。因此，寻找具有全新化学骨架、选择性更佳的变构调节剂有望为下一代蛋白酶抑制剂提供思路。20S核粒子(core particle, CP)是由两个外部α环和两个内部β环组成的圆柱形结构，每个β环由7个亚基组成。在真核生物中，20S蛋白酶体有6个催化位点，它们都具有相似的N端水解酶特征，但具有不同的底物和抑制剂偏好。20S蛋白酶体受到11S和19S调控蛋白的调控。这两种蛋白负责特定的底物识别，可打开圆柱体通道，让底物蛋白进入催化中心并将其降解。此外，20S核有3个内部腔室，两个形成于蛋白酶体CP入口的α-β环界面之间，一个中心腔室形成于6个β亚基内。它们显示出相邻的小口袋，可以被小分子结合。此外，20S蛋白酶体CP的动力学研究已证实其对20S CP调控和催化的重要性。蛋白酶体动力学可以被调节蛋白、底物和催化位点抑制剂变构调节。

已有研究表明，天然产物雷帕霉素和氯喹可以通过调节蛋白水解复合物的构象动力学发挥蛋白酶体的变构抑制剂的作用。变构途径可以多种途径改变蛋白酶体构象的平衡,使得CP处于非活化构象。这些途径包括：调节的CP圆柱体的开/关、阻碍CP与其激动剂的相互作用，以及避免底物多肽与对应的催化亚基发生进一步的反应。TROSY核磁图谱分析结果表明，氯喹与蛋白酶体的α-β界面结合，将20S CP的平衡态从多个异构体转变为非活性态，从而通过变构途径调节功能。天然产物雷帕霉素也能动态抑制蛋白酶体。Osmulski和Gaczynska使用原子力显微镜(AFM)20S蛋白酶体的CP进行了分析，结果发现雷帕霉素与CP孵育后，20S CP的孔径发生变化，使得其圆柱体通道处于打开的状态。

在转录过程中，转录因子通过与共激动蛋白(coactivator)和共抑制蛋白(corepressor)相互作用来调控其生物学功能。CBP/p300是与多种转录因子相互作用的共激活蛋白，如CREB、Myb和p53，进而调节它们的DNA结合和转录活性。CBP/p300共激活因子具有5个蛋白相互作用域。其中，CBP/p300的GACKIX结构域在转录因子激活中起关键作用，是其与靶向转录因子转录激活域(TADs)相互作用的重要界面。GACKIX结构域与p53、MILL、c-Jun、CREB、c-Myb和Tax的TADs相互作用。这些相互作用在一些生物过程和疾病中很重要。CBP/p300的GACKIX域显示了两个结合位点，它们可变构、协同地与TADs结合，根据它们的拓扑性质，分别被称为“深”和“浅”位点。2012年Majmudar等人拟通过荧光偏振分析的方法寻找对GACKIX-MLL TAD相互作用具有抑制作用的化合物。经过大量的筛选工作，该团队从65000个样品(其中50000个是合成化合物)中筛选得到了2个具有活性的样品，均为天然产物提取物。通过一系列的色谱学技术，他们获得了3个具有活性的天然产物，包括sekikaic acid。通过荧光实验和核磁共振研究，研究人员证实了该化合物确实可与该蛋白发生相互作用。此外，他们还进行了细胞功能分析和分子动力学模拟。

研究表明，sekikaic acid与GACKIX结构域的相互作用是发生在MLL(下图橙色部分)和c-Jun转录激活因子结合的“深”位点。小分子与GACKIX结构域的的结合了蛋白构象的改变，进而影响了GACKIX域与其它共激动剂(如CREB、c-Myb，下图中的黄色部分)的结合。与此同时，在GACKIX浅层的位点Lys662(图中蓝色部分)也发生了位移，而这个位点又与CREB的pSer133相互作用有关。综上所述，酚酸类化合物sekikaic acid可与CBP/p300的GACKIX结构域结合，选择性地破坏了CBP/p300与其转录激活因子MLL和KID(CREB)的相互作用。有趣的是，sekikaic acid不与其它共激动剂(如Med15和VP2)相互作用，对CBP/p300的GACKIX域展示出了良好的选择性。除此之外，研究人员也研究了lecanoric acid和lobaric acid对GACKIX的影响。Lobaric acid表现出TAD结合抑制，而lecanoric acid并没有展示出任何的活性。这可能是由于后者的结构更加柔性导致的。柔性阻碍了化合物与GACKIX结构域的稳定结合。