拿破仑·费拉拉和VEGF，离诺奖到底有多远？

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拿破仑·费拉拉和VEGF，离诺奖到底有多远？

血管生成抑制剂的研究与当前火热的免疫疗法、靶向疗法相比，仿佛已经是沉睡历史中的老人与过客。其实，血管生成机制的老大哥VEGF单抗的获批也不过是14年前的事。在联合疗法大行其道的今天，VEGF抑制剂是少见的与免疫检查点疗法在临床研究中表现出协调增效作用的机制之一，特别是在经历了IDO、Sting等接二连三的初步失败的之后。

VEGF的发现者拿破仑·费拉拉在今年获得引文桂冠奖，但好像没有什么人看好其获得诺奖的前景。VEGF的发现与药物研发的经历，究竟是还在诺奖的路上，还是已经被路边相忘？

VEGF的发现

从20世纪70年代开始，cDNA克隆方法的建立与发展以及蛋白质纯化技术的日趋成熟，使得许多蛋白质的纯化与鉴定成为可能。

1971年，Folkman发表了一篇早期研究和假设的综述，提出抗血管生成可能是一种抑制肿瘤生长的新策略。这一关键假设刺激了对血管生成调节因子的淘金热潮。到20世纪80年代中期，已经鉴定和表征了几种促血管生成分子，包括表皮生长因子（EGF）、肿瘤生长因子（TGF-α，TGF-β）、α–成纤维细胞生长因子（α-FGF，βFGF）和血管生成素（angiogenin）等等。但这些因子对血管生成好像不是绝对重要的。

1983年，Senger及其同事报道了血管通透因子（VPF），该蛋白质在皮肤注射时能够迅速增加血管通透性。然而，VPF在那时尚未得到完全纯化或克隆，因此，在接下来的几年中，阐明这种活性重要性的进展非常有限。

1988年，拿破仑·费拉拉（Napoleone Ferrara）加入基因泰克，最初的课题是松弛素。但Ferrara念念不忘在做博后时的课题，即血管生成因子的研究。Ferrara平时上班研究松弛素，周末加班主攻血管生成因子，仅用半年时间，Ferrara于1989年，在《科学》杂志上报道了VEGF的纯化和克隆的研究成果。VEGF是一种新型内皮细胞特异性促进细胞分裂的生长因子。在他们的工作被《科学》接受后，另一个独立的小组报告了VPF的克隆，证明其与VEGF的分子相同。从那时起，许多研究试图剖析VEGF的生理、病理学作用，探索可能的临床应用。

许多后续研究证明了VEGF在胚胎和出生后的血管生长、发育中的重要作用。甚至单个vegf等位基因的丢失就能够导致小鼠血管发育缺陷和早期胚胎致死。其他研究揭示了VEGF介导的血管生成在出生后关键生理过程中的作用，包括骨骼生长和卵巢黄体的周期性发展等等。

VEGF抗体的研发与抗癌

为了研究VEGF的作用，Ferrara在基因泰克最初开发了中和性鼠源单克隆抗体mAb。 1993年，Ferrara等在《自然》杂志上报道了中和人VEGF的所有生物活性形式的小鼠单克隆抗体A.4.6.1能够抑制免疫缺陷小鼠的人肿瘤细胞系的生长，完成了靶点有效性的最初概念验证。

经过繁杂的人源化改造，最终的人源化IgG抗体贝伐单抗（Bevacizumab，Avastin）具有与鼠源单抗 A.4.6.1基本相同的结合特征和活性。它抑制VEGF刺激的内皮细胞增殖和人肿瘤细胞系的体内生长，具有与鼠源单抗相同的功效。

1997年1月，Genentech提交了贝伐单抗的新药研究申请（IND），并于1997年4月开始在癌症患者中进行I期临床研究。在此期间，血管生成领域正在经历大喜大悲的震荡。

1997年，Boehm及其同事报道内皮抑素（胶原蛋白XVIII的一个片段）在动物模型中具有显著的抗血管生成作用能够导致小鼠模型中的肿瘤彻底根除，而不会诱导耐药性。抗肿瘤效果如此惊人，以至于当时人们相信，治愈癌症的新疗法很快就会出现。然而，随后用重组内皮抑素进行的人体试验并未显示出显著的获益。

另一个令人失望的进展是在20世纪90年代末和21世纪初期，不同类型的抗血管生成剂，基质金属蛋白酶抑制剂（MMPi）的失败。尽管有强大的临床前数据说服了几家制药公司为多种肿瘤类型开发MMPis，但所测试的抑制剂都没有显示临床疗效，失败的原因至今都尚不完全清楚。这些挫折，包括2002年VEGF贝伐单抗在复发乳腺癌患者的III期临床研究的失败，使人们对抗血管生成方法抗癌有效性产生了严重的怀疑。

因此，几乎每个人都对2003年6月ASCO年会上的一项III期研究报告感到惊讶，该研究显示贝伐单抗与化疗相结合，与单独化疗相比，导致未治疗晚期结直肠癌患者的无进展生存期和总生存期显著增加。贝伐单抗于2004年2月被FDA批准用于该适应症。随后的临床研究进一步证实了贝伐单抗在结直肠癌中的益处，并将其扩展到其他恶性肿瘤，包括非小细胞肺癌（NSCLC）、肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌和宫颈癌等。迄今为止，超过200万患者接受了贝伐单抗的治疗，如今，这种药物是肿瘤学中使用最广泛的治疗药物之一。

同时，贝伐单抗也成为基因泰克的抗癌生物药三驾马车之一，最近年销售稳定在60-70亿美元。

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罗氏/基因泰克抗癌生物药的三驾马车

当然有人指出，抗VEGF单抗在肿瘤学中赋予的益处可能并不特别显著。特别是与HER2抗体曲妥珠单抗（Herceptin）在乳腺癌取得的巨大成功相比。

然而，显著延长晚期癌症患者的临床益处，尤其是生存期，仍然是所有抗癌方法的主要挑战。在此背景下，贝伐单抗在最初批准后12年，仍旧代表了转移性结直肠癌一线和二线治疗的标准治疗。尽管在这些年中进行了许多新的临床试验，但是尚未有新的疗法能够明显超过贝伐单抗所带来的获益。

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VEGFR的发现及小分子激酶抑制剂的开发

血管生成研究领域另一个重要的里程碑是鉴定了两种VEGF酪氨酸激酶受体VEGFR1和VEGFR2。

1992年，Ferrara研究组与UCSF的Lewis Williams合作，将fms样酪氨酸激酶24（目前称为VEGFR-1）鉴定为高亲和力VEGF受体，文章发表在《科学》杂志。同年，Terman等人发现高度同源的酪氨酸激酶受体，称为KDR或VEGFR-2，文章仅发表在《BBCR》。现在已经确定VEGFR-2是主要的VEGF信号转导受体。人源VEGFR2的Y1175和Y951中的两个主要酪氨酸残基显示出差异调节血管生成和血管通透性的功能。

Angiogenic pathways and inhibitors for treatment of renalcell carcinoma

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在很长的一段时间，辉瑞的VEGFR及PDGFR等的酪氨酸激酶小分子抑制剂Sunitinib是治疗晚期肾细胞癌的一线选择，直到最近被Exelixis 的cabozantinib挑战成功。这种药物最初是在SUGEN发现的，后来被辉瑞收购。辉瑞当年对Sutent寄予厚望，希望它能够填补立普妥（Lipitor）专利悬崖带来的销售空缺。辉瑞同时大开了几十个临床实验，结果除了在肾细胞癌大获成功，在胃癌二线等可以应用以外，在诸多其它肿瘤类型，2年时间内，失败一个接着另一个，包括乳腺癌、转移性结直肠癌、晚期非小细胞肺癌和去势抵抗性前列腺癌等等。奇怪的是在VEGF抗体的成名处，转移性结直肠癌也大败而归。

Sunitinib不直接抑制肾癌细胞的生长，而是主要作用于肿瘤相关的新生血管。它的PFS比之前的标准疗法IFN-α有了较大的提高（11个月vs 5个月），大大减轻了晚期肾细胞癌的恶劣性。主要副作用为高血压（12％）、疲劳（11％）、腹泻（9％）和手足综合征（9％）等。

Cabozantinib 是一个多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，靶点包括RET、VEGFR、MET、KIT、AXL等。最初基于靶向RET获得FDA批准用于转移性甲状腺髓样癌。在与everolimus的二线应用比较中，cabozantinib表现出色，于2016年获批用于mRCC二线。2017年底，Cabozantinib与一线Sunitinib头对头比较，其PFS延长显著（8.6 vs 5.3 个月）而获得FDA批准用于一线。由于BMS的PD-1 抗体与CTLA-4 的组合疗法的生存获益比sunitinib也有显著提高而刚刚于2018年4月获得FDA批准用于晚期肾癌一线，有人担心cabozantinib的未来销售可能会大受影响。而刚刚披露Exelixis的2018-11-2 的季度财报显示，cabozantinib销售强劲，达到166M，比去年同期提高70%。看来，虽然cabozantinib毒性较大，但其获益提升还是得到医生、患者和支付系统的认可。

VEGFR的小分子抑制剂在肾细胞癌是最有效的适应症，多达7-9中不同的TKIs分列一线、二线。

FDA-approved targeted therapies related to VEGF/VEGFR in mRCC

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最近，VEGFR的多靶点激酶抑制剂开始在肝癌展现比标准疗法显著提高的疗效，虽然提高不是很大，但有时候，仅仅是些微统计学显著的提高也可遇不可得。

靶向VEGF/VEGFR的挑战

一个关键问题是如何识别那些从抗VEGF疗法中获得最大益处的患者。因此，鉴定特定的预测性生物标志物仍然是一个尚未解决的主要目标。潜在的生物标志物包括肿瘤内和血浆VEGFA水平，以及KRAS和BRAF状态，虽然目前预后不能完全预测对贝伐单抗或VEDFR小分子抑制剂治疗的反应。

其它许多VEGFA抑制剂的预测生物标志物，包括高血压、肿瘤成像、促炎细胞因子、可溶性VEGFA受体和VEGFA途径基因中的多态性，已经在小规模患者系列或回顾性分析的基础上提出，但尚没有一个经过大型临床验证的定论。

这可以反映诸如血管生成的过程的复杂性，其受微环境内的多种因素影响，而不仅仅是测量肿瘤内在变化，例如癌基因突变或扩增。因此，预测抗VEGFA功效的生物标志物可能对不同组织和肿瘤亚型具有特异性。

尽管抗VEGFA治疗，许多患者仍会有进展，这表明耐药性仍旧会发生。然而，这些机制似乎与通常靶向疗法发生的机制不同，到目前为止，没有令人信服的证据表明VEGFA或其受体的突变是抗药性的发生的原因。

VEGF抗体药在眼科疾病中大放异彩

Ferrara自己也承认，抗VEGF治疗最显著的成功可能不是癌症，而是眼科学。

早在1956年， George Wise就预测有一种神秘因子X，能够诱导眼病变中的新血管生成。1984年，有人认为FGF也许就是因子X。但随后1989年发现的VEGF更加符合因子X的标准。

到20世纪90年代中期，强有力的相关证据表明VEGF可导致继发于糖尿病，早产或视网膜静脉阻塞的视网膜缺血相关新生血管综合征（1994，The American Journal of Pathology）。玻璃体内注射mAb A.4.6.1导致视网膜静脉阻塞的灵长类动物模型中新血管形成的显著抑制，从而为VEGF在该过程中的关键作用提供了概念验证证据。

VEGF贝伐单抗于2004 获批用于抗癌治疗。而从2005开始，小规模的单臂临床实验显示其用于治疗湿性黄斑变性眼病（wet-AMD）效果极其显著，眼科医生开始标签外开给患者使用。

最初，基因泰克以为分子量较大的贝伐单抗通过视网膜扩散到达脉络膜也许会存在困难，于是专门开发了一个小分子量的贝伐单抗的片段，叫雷珠单抗（ranibizumab )，经过临床验证，显示雷珠单抗治疗湿性AMD效果显著而获得FDA批准（2006-6-30）。于此同时，进一步的研究却也发现，贝伐单抗也能够有效的扩散到病变的脉络膜起作用。而随后的临床实验也表明，贝伐单抗与雷珠单抗治疗湿性AMD的效果几乎相同。

Regeneron则利用不同的抗VEGF策略，开发出VEGF-trap (aflibercept)，作为VEGF的诱饵受体起作用。VEGF-trap的活性与贝伐单抗或雷珠单抗相比，活性提高了100倍，半衰期也有所延长。临床实验显示，每2个月注射一次aflibercept不劣于每月注释雷珠单抗。FDA于2011年11月18日批准了aflibercept用于湿性AMD。

Comparison of anti-VEGF drugs for wet-AMD

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而抗VEGF的手段还不断在扩展适应症，可以用于多种严重的由血管增生引起眼部病变。

尽管贝伐单抗不是为眼科适应症而开发的，但由于其成本低，它在标签外被广泛使用（超过半数），价格仅约为ranibizumab的六十分之一，这使得许多患者能够获得导致视力改善的治疗。而许多保险公司甚至指定要优先使用贝伐单抗。

最近的研究报道了贝伐单抗或雷珠单抗治疗湿性AMD患者5年的结果。 50％的患者视力良好（20/40或更好）。在获得抗VEGF药物之前，在疾病进展到5年时，几乎所有湿性AMD患者的视力严重受损或失明，抗VEGF治疗眼科疾的确是革命性的进步。

结语

鉴于拿破仑·费拉拉的VEGF发现，他在2010年获得了拉斯克奖。2013年，他获得了总共300万美元的首届生命科学突破奖（分享），奖金甚至超过诺贝尔奖。

2013年，加州大学圣地亚哥分校花费约1000万美元的招聘方案，成功吸引费拉拉加入该校。

由于NGF和EGF生长因子的原创发现，Levi Montalcini与Stanley Cohen于1986年已经获得过诺贝尔生理学或医学奖。这的确限制了另外一个生长因子获奖的概率。而VEGF抗体在眼科疾病中的疗效却的确是颠覆性的。诺奖风向标拉斯克及科学突破奖也肯定了VEGF发现的重要性。

拿破仑.费拉拉和VEGF到底是在诺奖的路上，还是，路边望（忘）？笔者看好这个相对冷门的领域在将来爆冷的机会。

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9.A conversation with Napoleone Ferrara. JCI, 2014, 10.1172/JCI77540.

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