NK细胞疗法擘画未来

二十年前，当用作免疫治疗剂的NK细胞在晚期白血病患者的治疗中显示出安全性和有效性时，NK细胞疗法获得“入场券”。近年来，随着嵌合抗原受体（CAR）工程过继性T细胞疗法的成功以及可以将细胞转化为强大的抗肿瘤武器技术的进步，大家对NK细胞作为免疫疗法候选者的兴趣呈指数级增长。

在临床上，第一代NK细胞疗法取得了可喜的效果，显示出令人鼓舞的疗效和良好的安全性，从而激发了对NK细胞疗法的巨大热情。在本文中，我们介绍增加NK细胞毒性和寿命的各种方法，迎接挑战和抓住机遇，并从经验教训中指导下一代NK细胞产品的设计。

作者 | 小鱼

NK细胞功能、来源和供体选择

自然杀伤（NK）细胞由独特的先天淋巴细胞群组成，具有识别和杀死病毒感染细胞和肿瘤细胞的潜在能力。NK细胞具有多种细胞毒性机制，还可以分泌细胞因子调节免疫反应，在抗癌免疫中起着关键作用。在癌症患者中，NK细胞通常表现出功能失调的表型，其特征在于基因表达谱改变和细胞毒性功能降低，从而降低了自体NK细胞治疗应用的可行性。

NK细胞的来源多种多样（图1），即外周血单核细胞，脐带血，永生化细胞系、造血干细胞、祖细胞（HSPC）和诱导多能干细胞（iPSC）。所有来源都可以提供具有临床意义的细胞剂量，适合CAR受体工程，并已过渡到人体研究。每个来源都有自己的优点和潜在的挑战。嵌合抗原受体（CAR）NK细胞已成功从包括脐带血在内的不同平台进行工程设计。

图2 不同来源的NK细胞的优点和局限

NK-92是第一个获得美国食品和药物管理局（FDA）批准进行临床试验的NK细胞免疫疗法，是一种均匀的、永生的NK淋巴瘤细胞系，可以离体扩增（表 1）。NK-92细胞缺乏大多数KIRs的表达，因此不太可能被抑制。然而，它们的癌源性引起了安全性问题，并且在患者给药之前需要照射NK-92衍生的细胞产物，这反过来又会对其体内的长期持久性和整体性治疗潜力产生负面影响。另一个缺点是，由于缺乏CD16表达，NK-92细胞缺乏通过ADCC介导细胞杀伤的能力。

iPSCs是NK细胞的一个令人感兴趣的来源，iPSCs能够高效地克隆生长和扩增，还能体外分化。这些特点使得iPSCs可以制造大量均匀的NK细胞产品。一个潜在的缺点是iPSC来源的NK细胞通常表达低水平的内源性CD16，这可以通过基因工程来缓解。另一个可能的担忧是，iPSC可能含有与其来源的体细胞组织一致的DNA甲基化特征，这种“表观遗传记忆”可能会影响与供体细胞不同的特定细胞谱系的发育。尽管如此，越来越多的基因工程iPSC-NK候选细胞正在临床前研究中出现，其中一些已经过渡到临床试验。在一项 I/II期试验中，表达 CAR 的 iPSC-NK 细胞在复发或难治性（R/R）弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中显示出令人鼓舞的结果，既可作为单一疗法，也可与CD20靶向药物联合使用。

原代NK细胞可以从外周血（PB-NK细胞）中收获或来自脐带血（CB-NK细胞）。CB-NK细胞可以通过血库从货架上冷冻出来，而PB-NK细胞需要分离健康供体和供体特异性收集。PB-NK细胞是2005年由Dario Campana领导的首次成功将CAR构建体递送到NK细胞中的平台。今天，PB-NK细胞为目前正在临床试验的各种产品提供了基础材料（表1）。Laskowski正在进行的I /II期临床试验中证明了基因工程脐带血来源的CD19-CAR NK细胞对R / R CD19淋巴样恶性肿瘤有临床疗效。

表1 CAR工程NK细胞治疗产品的临床研究

来自这些来源的NK细胞已被证明在过继细胞治疗应用中具有优点和缺点，应定制平台以满足每个患者群体和疾病适应症的需求。

增强NK细胞健康和抗肿瘤功能

①嵌合抗原受体

嵌合抗原受体（CARs）是合成的融合蛋白，包括细胞外抗原识别域和触发细胞活化的细胞内信号传导部分。CARs可以在免疫效应细胞上表达，以重新编程其对特定靶标的特异性（图3a）。CAR工程T细胞疗法是第一个出现的，为免疫肿瘤学应用开发了各种产品。此后，该领域不断扩大，NK细胞也被整合到基因工程管道中。传统上为T细胞设计的CAR已被用于CAR NK细胞的产生，研究表明这些细胞可以靶向特异性肿瘤，同时保持理想的安全性（图4a）。细胞内抗原以肽-HLA复合物的形式存在，通过TCR检测。工程NK细胞表达TCR可以检测这种肽（图3b）。TCR引导的NK-92细胞最近被证明可以引发抗肿瘤反应。

图3 增强NK细胞特异性的策略

②NK细胞衔接器

NK细胞也可以通过衔接器引导到肿瘤部位，通过触发NK细胞上的激活受体来引发强烈的NK细胞介导的抗肿瘤反应，同时结合肿瘤细胞上的靶抗原（图3c）。开发策略包括三个特异性或四个特异性设计，靶向肿瘤上的多种抗原，或通过交联细胞因子部分，促进NK扩张和存活，旨在增强抗肿瘤作用。细胞衔接器的使用绕过了工程设计的需求，不需要载体介导的基因转移，因此代表了一种更简单，成本更低的制造工艺，来提供能够诱导CAR样活性的产品。

③细胞因子

细胞因子可以增强NK细胞毒性并加快NK细胞增殖，将细胞维持在健康，非耗尽的状态。但连续的离体刺激会使NK细胞“细胞因子上瘾”，并在没有体内细胞因子支持的情况下输注这些细胞时会降低持久性。为了避免这个问题，同时仍然利用细胞因子激活的益处，该领域已经转向基因工程，通过基因工程，NK细胞被修饰以产生细胞因子，维持细胞效力，增殖和持久性（图4e）。这种自分泌维持引起了人们的极大兴趣，CAR工程化的NK细胞正在出现。

图4 CAR设计的原则和策略

④克服免疫抑制

肿瘤通常表现出异常的代谢行为，导致肿瘤生存环境中乳酸水平升高以及有毒分解代谢物，腺苷和活性氧的浓度增加。此外，TME内存在不断增殖且功能失调的脉管系统和免疫抑制细胞亚群，导致冒险进入TME的免疫效应细胞命运惨淡。为了克服代谢免疫抑制的有害影响，目前的策略主要集中在两个方面：改变肿瘤的代谢构成或修改免疫细胞中的基因表达程序，以保护它们免受TME中抑制性代谢物的侵害；通过小分子抑制剂或拮抗抗体阻断肿瘤细胞上的CD73克服腺苷介导的免疫抑制。此外，在临床前研究中，通过基因编辑删除CAR T细胞和CAR NK细胞中的腺苷A2A受体，显示出抗肿瘤的功效。（图5a）。

⑤检查点中断

肿瘤已经进化出复杂的机制来逃避免疫监视，比如免疫检查点的参与，使用相应单克隆抗体可以逆转肿瘤引起的体外NK功能障碍。然而依靠单克隆抗体来调节患者的免疫细胞，由于其体内半衰期有限，需要多次输注。随着基因编辑能力的进步，NK细胞可以被稳定修饰，以增强NK细胞功能。一个例子是抑制性受体NKG2A的遗传破坏，这导致在接种HLA-E肿瘤的异种移植小鼠模型中具有更好的肿瘤抑制作用（图5b）。此外，在确定CISH（细胞因子诱导的含SH2蛋白）作为NK细胞功能的关键负调节蛋白后，设计了缺乏这种细胞内细胞因子检查点的CAR NK细胞，其代谢适应性和抗肿瘤活性明显提升（图5c）。

⑥加强NK细胞向肿瘤的运输

NK细胞进入和穿透肿瘤床的能力是有效抗肿瘤免疫的关键。NK细胞与其他免疫细胞类似，通过趋化因子受体及其在TME中分泌的同源配体的动态相互作用被引导到肿瘤部位。由于内化和降解导致趋化因子表达的迅速丧失，因此越来越多策略采用基因工程来为NK细胞配备稳定的异位趋化因子受体（图5d）。

图5 克服NK细胞功能抑制的基因工程策略

临床经验教训

CAR-T细胞治疗已经带来了显著的临床结果，一些患者在CAR-T细胞持续存在的情况下实现了长达十年的有效治疗。这种新形式的细胞免疫疗法也显示出治疗各种癌症的潜力，推动了越来越多新策略的发展。在过去的十年中，该领域已经看到NK细胞成为一种强大的候选药物，其生物特性可能有助于克服基于T细胞的方法所发现的一些局限性。一个值得注意的发现是，早期临床数据表明NK细胞非常适合用于异体治疗环境。虽然安全性结果令人鼓舞，但还需要进一步研究以阐明同种异体NK细胞是否能够逃避T细胞的排斥反应以获得长期持久性。越来越多的临床研究表明，来自外周血单核细胞、脐带血、iPSCs和HSPCs的NK细胞在治疗血液系统恶性肿瘤方面具有安全性和有效性。此外，NK细胞非常适合进行基因修饰，并且已经设计了许多临床候选细胞，以更精确地靶向肿瘤并增加持久性。此外，持续努力加强肿瘤部位的运输（通过趋化因子受体编辑）（图5d）和屏蔽TME中的抑制因素（通过检查点抑制，代谢重编程（图5a）和缺氧耐受性）可能会增加临床益处。重要的是，无论采用哪种方法，NK细胞疗法都一直显示出良好的安全性，并且迄今为止，没有观察到CRS或GvHD。

尽管已经取得了巨大的进步，并且在短时间内NK细胞已成为免疫肿瘤学的重要工具，但大多数报道的成功仅限于血液系统恶性肿瘤，就像CAR T细胞的初始功能一样。并非所有患者都对NK细胞治疗有反应，有些患者最终会复发。肿瘤耐药和复发的机制是什么？肿瘤细胞，以及同样具有治疗作用的NK细胞，是否在其相互作用过程中进化？了解影响患者反应的生物学基础对于回答这些问题至关重要。在当前单细胞多组学的时代，我们准备将这些挑战视为机遇。此外，实施联合治疗方法可能为实现协同效应和提高工程过继NK细胞疗法的疗效提供策略（表2）。例如，抗体或小分子抑制剂的整合以防止代谢物驱动的免疫抑制，或阻断检查点和免疫抑制机制（图5b，e）：增强CAR NK细胞功能，阻碍TME中抑制细胞的信号并支持其他免疫效应细胞的功能。最后，工程NK细胞对CD38介导的自相残杀具有抗性，可以将基于NK细胞的治疗方法与抗CD38单克隆抗体相结合，治疗早期多发性骨髓瘤（图5f）。

表2 提高CAR NK细胞治疗效力的组合策略

小结

尽管基于NK细胞的免疫疗法作为一种安全的现成的抗肿瘤疗法具有很好的前景，但重要的问题仍然存在。首先，阐明决定NK细胞效力和持久性的关键参数将非常重要。其次，使用共刺激信号，细胞因子或与其他治疗方式组合，将最大化延长过继性NK细胞的寿命。最后，开发和实施NK细胞扩增和冷冻保存的最佳方法，以维持产品的高质量。从逻辑上讲，为了使新兴的NK细胞治疗计划取得成功，必须建立由研究人员，临床医生和监管人员组成的多学科团队，共同搭建出临床转化的整体框架。

参考文献

Laskowski, T.J., Biederstädt, A. & Rezvani, K. Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy.Nat Rev Cancer (2022). https://doi.org/10.1038/s41568-022-00491-0

封面图来源：123rf