FLT3抑制剂治疗AML研究进展

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FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）是一种Ⅲ型受体酪氨酸激酶，在造血细胞的存活、增殖和分化中起着重要作用。FLT3基因突变是急性髓系白血病（AML）患者最常见的基因改变和预后不良因素。

FLT3突变主要有两种类型：膜旁结构域(juxtamembrane)的内部串联重复突变（FLT3-ITD）和酪氨酸激酶结构域的点突变（FLT3-TKD）或缺失。两种突变的FLT3分子都可以非配体依赖的二聚和反式磷酸化被激活的。突变型FLT3诱导多种细胞内信号通路的激活导致细胞增殖和抗凋亡，主要包括STAT5、MAPK和AKT等。

由于大剂量化疗和异基因造血干细胞移植不能充分改善预后，FLT3激酶抑制剂正成为AML治疗的研究热点。

从首次发现FLT3突变到FLT3抑制剂获批用于临床，人们花20多年的时间。虽然3种FLT3抑制剂在日本和/或欧洲和美国先后被批准上市，用于单药治疗或与常规化疗药物联合治疗AML患者；但FLT3抑制剂仍有很多问题，并且耐药问题也已出现。

FLT3抑制剂的耐药机制比较复杂，耐药细胞往往具有异质性。因此，迫切需要进一步的基础和临床研究，以为FLT3突变型AML患者制定最佳治疗策略。

1. 背景

FLT3和KIT、FMS和PDGFR一样，是一种III型受体酪氨酸激酶（RTK）。

FLT3由胞外五个免疫球蛋白样结构域、一个并列膜（JM）结构域、一个由激酶插入结构域及其酪氨酸激酶（TK）结构域组成，以及细胞内区域的C端结构域。

图1. FLT3结构

FLT3在正常造血干/祖细胞上表达，其配体（FL）通过骨髓基质细胞以膜结合或可溶性形式表达。FLT3细胞外结构域与FL结合进而而二聚，活化环（A-loop）中的酪氨酸残基随后被反式磷酸化。激活的FLT3诱导多种细胞内信号通路，导致造血细胞存活、增殖和分化。

图2. FLT3的活性和非活性构象

FLT3也在大多数急性白血病细胞上表达，FL刺激促进增殖并减少凋亡。1996年，FLT3基因JM结构域内部串联重复（FLT3-ITD）在急性髓系白血病（AML）细胞中被首次发现。随后，人们发现了D835残基点突变，以及TK结构域内D835附近其他密码子的缺失和插入突变。

FLT3-ITD和FLT3-TKD分别发生在约20%和10%的AML中。由于FLT3突变是AML最常见的基因突变，并与预后不良有关；因此，突变型FLT3是治疗AML的一个很有前途的治疗靶标。

在发现FLT3基因突变20多年后，FLT3抑制剂终于被批准用于临床，从而使FLT3突变的AML治疗发生重大变化，进入靶向治疗时代（图3）。

在这篇综述中，我们总结了FLT3突变的临床和生物学意义，并讨论了FLT3抑制剂的相关进展和未来策略。

图3.FLT3抑制剂的研发历程

2. FLT3突变的临床意义

到目前为止，AML的基因改变已经被下一代测序几乎完全确定。多项综合遗传学研究表明，AML患者中高频突变基因包括FLT3、NPM1和DNMT3A等。

尽管他们的频率在所有队列分析中稍有不同，但在大约30%的AML患者中发现了FLT3突变。在日本的一项成人白血病AML201研究中发现：FLT3是最常见的基因突变，约占所有患者的25.4%（图4a）。

FLT3突变主要见于髓系肿瘤，如AML和骨髓增生异常综合征（MDS）。在MDS中，FLT3-ITD和FLT3-TKD的突变比较罕见，在3%左右；而在晚期MDS中，突变几率大幅增加；但大约15%由MDS发展为AML的患者携带FLT3突变。

FLT3-ITD在急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中较少见，而FLT3-TKD在KMT2A基因重排或超二倍体患者中经常出现。

FLT3突变可能与AML患者的年龄有关。大约25%的成人患者中发现FLT3-ITD，但在55岁以上患者的比例则超过30%。相反，只有大约10%的儿童患者和不到5%的1岁以下的婴儿AML患者中发现FLT3-ITD。

图4.AML患者中的FLT3高频突变及其他基因突变（日本）

FLT3突变与特定细胞遗传学或其他基因突变有关。FLT3突变在细胞遗传学正常的AML（CN-AML）中常见，但在核型改变的AML中不常见；然而，伴有DEK-NUP214和PML-RARA（急性早幼粒细胞白血病，APL）异常的患者经常携带FLT3突变。

FLT3突变在由RUNX1-RUNX1T1和CBFB-MYH11异常的AML（CBF-AML）中并不常见。虽然FLT3-TKD在CBFB‐MYH11.28的AML中经常发现，但FLT3突变在NPM1、DNMT3A和KMT2A突变患者中比较罕见，可能与KIT、K/NRAS和CEBPA-double（CEBPA-D）突变存在相互排斥（图4B）。

FLT3突变和其他突变同时发生细胞遗传学和基因改变反映了这样一个概念：AML是两大类互补突变的结果：那些赋予造血祖细胞增殖和/或生存优势的突变，包括酪氨酸激酶（如KIT和FLT3）或其下游效应器（如RAS）的激活突变损害造血分化并赋予自我更新特性，包括PML-RARA、RUNX1-RUNX1T1和CBFB-MYH11或NPM1和DNMT3A突变。

FLT3突变与急性髓系白血病患者的白细胞增多以及外周血和骨髓中原始细胞百分比的增加密切相关。数项大规模研究表明，FLT3-ITD是AML而非APL患者的总生存率（OS）、无复发生存率（RFS）和无事件生存率（EFS）的独立不良预后因素。尽管FLT3-TKD对长期预后的临床影响存在争议，但我们对包括1160名成人AML患者在内的四项已发表研究进行的荟萃分析表明了其不良影响。

由于FLT3突变与AML患者的不良预后密切相关，WHO、欧洲及美国的指南建议，应分析FLT3突变，以便在AML诊断时将患者分为不同的危险组。2010年欧洲ELN指南首次推荐了基于细胞遗传学和遗传状况的风险分类系统（ELN-2010）：在该系统中，NPM1突变和野生型FLT3的CN-AML患者被归类为一个良好的风险组，而那些患有FLT3-ITD的患者被分为一个中间II组。

最近，ELN修订了AML的风险分层系统（ELN-2017），其中FLT3-ITD的等位基因比率（AR）被考虑用于风险分层。因为一些研究组证明，高FLT3-ITD AR（allelic ratio，≥0.5）（FLT3-ITDHHIGH）与预后不良相关。

尽管有报道称大剂量柔红霉素和吉妥珠单抗（Gemtuzumab ozogamicin，CD33-ADC）可降低FLT3突变的不良影响，但回顾性分析表明异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）并不能改善FLT3突变患者的不良预后。因此，FLT3抑制剂等新疗法对FLT3突变的患者带来新的希望和选择。

3. FLT3突变对急性髓系白血病的生物学效应

野生型（Wt）FLT3通过配体依赖的二聚和反式磷酸化被激活。活化的Wt-FLT3诱导MAPK和AKT为主的多种细胞内信号通路的激活，导致细胞增殖和抗凋亡。

突变体FLT3能够配体非依赖的形成二聚体，导致持续性激活。值得注意的是，突变体FLT3除了激活MAPK和AKT信号外，还激活STAT5。

在体外，已证明持续激活的突变FLT3激酶诱导细胞因子依赖的细胞系如Ba/F3，FDCP1和32D细胞等转变为自主增殖。

另外，移植了突变型FLT3转染造血干细胞的小鼠会出现寡克隆性骨髓增生性疾病（oligoclonal myeloproliferative disorder，MPD），而不是克隆性AML。然而，当突变的FLT3转染的PML-RARA表达或dnmt3a无效的造血干细胞被移植后，小鼠迅速发展成AML。

这些结果共同表明，突变型FLT3足以诱导MPD，但额外的突变损害造血分化和/或增殖对于克隆型AML的发展是必要的。

4. 一代FLT3抑制剂

第一代FLT3抑制剂，包括坦度替尼（tandutinib）、舒尼替尼（sunitinib）、米哚妥林（midostaurin)、来他替尼（lestaurtinib）和索拉非尼（sorafenib）等（表1）。

图.5 FLT3抑制剂的选择性

但在早期研究中，一代FLT3抑制剂单药治疗AML的疗效并不显著，其疗效较差并且伴随较多的不良反应。此外，研究表明，维持有效的抑制剂血浆浓度对实现临床疗效至关重要。

表1. 临床开发的FLT3抑制剂

血药浓度是影响药物药理作用的重要因子。然而，它不能反映FLT3抑制剂的临床疗效，因为大多数抑制剂与血浆蛋白结合，导致实际发挥药理作用的游离化合物减少。如表1所示，人血浆中FLT3抑制剂的GI50值高于体外IC50，特别是，米哚妥林（midostaurin)、来他替尼（lestaurtinib）的GI50值比IC50高300倍以上。

血浆抑制活性（ plasma inhibitory activity，PIA）测定取代血药浓度已被确立为评价FLT3抑制剂临床疗效的新指标，并已纳入临床试验的评价标准。在PIA分析中，将表达突变型FLT3的细胞与来自给药患者的血浆一起培养，然后通过western blot分析评估突变型FLT3的磷酸化状态。一般情况下，比较给药前血浆和给药后血浆中的磷酸化状态。

先前的临床试验表明，当突变型FLT3的磷酸化被完全抑制时，FLT3抑制剂的临床疗效甚至可以通过PIA试验完全抑制。PIA分析清楚地表明，即使在目标血药浓度下，一代FLT3抑制剂也不能充分抑制突变型FLT3的磷酸化。特别是，由于米哚妥林（midostaurin)、来他替尼（lestaurtinib）由吲哚卡巴唑分子组成，该分子已知与人血浆中的酸性糖蛋白（AGP）紧密结合，PIA分析表明，这些化合物的血浆浓度无法达到生物有效水平。

由于药理和临床上的缺陷，一代FLT3抑制剂作为AML的单一疗法的临床研究已经停止。因此，米哚妥林（midostaurin)、来他替尼（lestaurtinib）和索拉非尼联合化疗治疗伴有FLT3突变的AML患者进行了评估。

尽管在临床试验中，在常规化疗中添加来他替尼或索拉非尼并没有显示出益处，但一项随机的3期临床研究表明，除了常规诱导和巩固化疗外，米哚妥林（midostaurin)在总体生存率（OS）方面表现出一定优势。基于这项研究，米哚妥林于2017年被美国FDA批准上市，用于与标准化疗的联合用药治疗AML。

值得关注的是，索拉非尼维持治疗显著改善了FLT3-ITD AML患者allo-HSCT后的RFS和OS。值得注意的是，有报告认为，索拉非尼由于促进IL-15和供体细胞毒性T细胞活性的增加，可能诱发移植物抗宿主病（GVHD）。

代表性FLT3抑制剂结构

5. 二代FLT3抑制剂

由于一代FLT3抑制剂最初并未针对活化的FLT3激酶进行敏感性和选择性筛选，因此更高的选择性和更强的抑制活性的二代FLT3抑制剂被开发出来（表1）。

5.1 吉瑞替尼（Gilteritinib）

是一种高选择性和高活性的FLT3抑制剂，同时具有AXL抑制活性。吉瑞替尼于2018年日本批准上市，成为首个单药用于治疗FLT3突变的R/R AML患者的药物。

AXL在恶性细胞（包括AML）中被上调和激活，其高表达被报告与不良预后相关。

此外，据报道，FLT3抑制剂诱导AXL活化，降低其体外生长抑制作用。

在252例18岁以上复发或难治性(relapsed or refractory ,R/R) AML患者的1/2期试验中，研究了吉瑞替尼（Gilteritinib）在20至450毫克/天的剂量范围内的安全性和有效性。PIA分析显示，在>80毫克/天时，FLT3磷酸化的抑制率>90%。

在一项针对伴有FLT3突变的R/R型AML的3期试验的中期分析中，吉瑞替尼显示出优于常规化疗的完全缓解（CR）和部分血细胞恢复（CRh）的完全缓解CR。此外，对主要终点的后续分析表明，吉瑞替尼治疗的患者（9.3个月）的中位OS明显长于常规化疗患者（5.6个月）（P<0.001）。

5.2 奎扎替尼（Quizartinib）

奎扎替尼（Quizartinib ）对FLT3-ITD具有高度的选择性和较强的抑制活性，但对FLT3-TKD较弱。2019年，奎扎替尼（Quizartinib ）被批准用于治疗伴有FLT3-ITD的R/R AML患者。

在R/R AML患者中进行1期和2期临床试验中，奎扎替尼（Quizartinib ）对FLT3-ITD阳性AML的有效率>50%患者；然而，在有反应的患者中观察到许多伴有不完全血液学恢复（CRi）的CR病例，并且QTc延长被证明具有明显的毒性。有人认为，奎扎替尼（Quizartinib ）治疗后血细胞恢复不良是由于其对KIT的抑制活性引起的。

在R/R FLT3-ITD阳性AML的3期试验中，通过调整给药剂量可降低QTc延长的频率，奎扎替尼（Quizartinib ）治疗的患者（6.2个月）的中位OS明显长于常规化疗患者（4.7个月）（P=0.02）。

5.3 Crenolanib（CP-868596）

对FLT3-ITD和FLT3-TKD均有抑制作用。它对PDGFR也有抑制作用。一项涉及FLT3突变阳性R/R AML患者的单药2期试验显示：Crenolanib的治疗有效率为47%，但同时发现其具有消化系统毒副作用。

Crenolanib与米哚妥林治疗首次确诊的FLT3突变AML患者的3期临床试验，正在进行之中。

6. FLT3抑制剂的主要耐药机制

尽管三种FLT3抑制剂已在日本、欧洲和美国获批用于临床，但FLT3抑制剂耐药的出现限制了其临床疗效的进一步提高。

这些耐药机制可分为原发性耐药机制和获得性耐药机制。原发性耐药包括FLT3突变（FLT3-ITD和FLT3-TKD）介导的耐药、FL依赖性耐药、FGF2促进的耐药、骨髓基质CYP3A介导的耐药性和其他激活信号介导等（图6）。

图6. FLT3抑制剂耐药机制

6.1 I型和II型抑制剂

由于FLT3抑制剂与FLT3-ITD和FLT3-TKD亲和力的不同，造成了对其抑制活性的差异。

根据活化环（A-loop）中DFG三个氨基酸残基的方向的不同，FLT3具有活性或非活性构象。根据抑制剂与FLT3结合方式，FLT3抑制剂可分为两大类（Ⅰ型和Ⅱ型）。I型抑制剂可与FLT3的活性构象和非活性构象结合，但II型抑制剂只能与非活性构象结合（图7）。

米哚妥林（midostaurin)、吉瑞替尼（Gilteritinib）和Crenolanib是I型抑制剂，其设计目的是对FLT3活性构象的ATP结合区具有高度亲和力。由于许多激酶的ATP口袋同源性较高，所以I型抑制剂是多激酶抑制剂。

奎扎替尼（Quizartinib）和索拉非尼（sorafenib ）是II型抑制剂。它们与非活性构象的ATP结合区的后口袋结合，并与相关氨基酸残基的侧链相互作用，提高抑制活性和选择性。然而，它们失去了与FLT3活性构象的亲和力。

图7. FLT3抑制剂的结合模式

6.2 FL相关耐药

FLT3抑制剂的FL依赖性耐药是临床上AML重要的耐药机制。据报道，化疗后血浆FL浓度的增加阻碍了FLT3抑制剂的疗效。

我们发现大多数FLT3突变的AML细胞往往共同表达Wt-FLT3，这能够解释FL依赖性的Wt-FLT3激活降低了FLT3抑制剂的抑制作用。

我们使用唯一表达FLT3-ITD-FLT3及Wt-FLT3/ITD-FLT3共表达的32D细胞评估了FLT3抑制剂在有无外源FL的情况下的生长抑制作用，发现：

与单一的ITD-FLT3细胞相比，FL刺激显著增加Wt-FLT3和ITD-FLT3共表达细胞中所有FLT3抑制剂的GI50值。
在只表达ITD-FLT3的细胞中，奎扎替尼（Quizartinib）抑制ITD-FLT3及其下游分子STAT5、AKT和MAPK的磷酸化。即使添加FL后ITD-FLT3被重新磷酸化，但下游分子并不受FL的影响。
相反，在Wt-FLT3/ITD-FLT3共表达细胞中，在quizartinib存在的情况下，FL只能激活的Wt-FLT3，而不能激活ITD-FLT3。在激活Wt-FLT3的同时，AKT和MAPK（而不是STAT5）被FL重新磷酸化。
在激酶死亡（KD）FLT3（K644A）和ITD-FLT3共表达细胞中，FL既不激活MAPK，也不影响FLT3抑制剂的生长抑制作用。

这些结果表明，FL激活了共表达细胞中的Wt-FLT3，而不激活ITD-FLT3。

此外，MEK抑制剂能够阻断了FL介导的FLT3抑制剂耐药作用，这表明FL依赖性激活Wt-FLT3-MAPK轴是FLT3抑制剂抵抗FLT3的关键机制。

有趣的是，在Wt-和ITD-FLT3共表达细胞中，添加FL能够更加明显的降低吉瑞替尼（Gilteritinib）、奎扎替尼（Quizartinib）和索拉非尼（sorafenib ）的AML抑制活性（表1），而对米哚妥林（midostaurin)和来他替尼（lestaurtinib）的活性影响较弱。

尽管米哚妥林（midostaurin)和来他替尼（lestaurtinib）对ITD-FLT3和Wt-FLT3具有相似的抑制活性，但吉瑞替尼（Gilteritinib）、奎扎替尼（Quizartinib）和索拉非尼（sorafenib ）对Wt-FLT3的抑制作用低于ITD-FLT3。

6.3 其他耐药机制

除FL外，骨髓微环境中的其他细胞因子、生长因子和可溶性蛋白对奎扎替尼耐药中的作用也被报道。

成纤维细胞生长因子2（FGF2）通过激活FGFR1和下游MAPK效应器促进耐药。使用奎扎替尼治疗的FLT3-ITD阳性AML患者骨髓基质细胞中FGF2的表达增加，并且在明显的临床复发和检测耐药突变之前表达水平达到峰值（图6）。
骨髓基质细胞中CYP3A4的表达可抑制三种不同的FLT3抑制剂（索拉非尼、奎扎替尼和吉尔特替尼）对抗FLT3-ITD阳性AML的活性（图6）。

7. FLT3抑制剂的继发耐药机制

针对FLT3抑制剂的继发耐药机制分为靶标相关和靶标非相关耐药机制。

7.1 靶标相关的耐药(on-target resistance)

在靶标相关的耐药中，白血病细胞对FLT3信号仍有依赖性，但通过获得FLT3基因突变对FLT3抑制剂表现出耐药性（图6）。

在奎扎替尼（Quizartinib）治疗后复发的FLT3-ITD患者中首次鉴定了获得性耐药突变。在耐药患者中，FLT3激酶结构域中的D835残基、Y842残基或看门人残基F691处发现获得性突变，表达FLT3-ITD-D835Y、D835V、Y842C、Y842H或者-F691L的Ba/F3细胞能够耐受奎扎替尼（Quizartinib）的生长抑制和去磷酸化活性。

在使用另一种II型抑制剂索拉非尼治疗的患者中也发现了A-loop中的这些耐药突变。这种获得性耐药降低了Ⅱ型抑制剂对激活型FLT3的亲和力，进而由FLT3-TK结构域突变介导耐药。

值得注意的是，II型抑制剂奎扎替尼（Quizartinib）临床耐药患者中FLT3-ITD等位基因获得性突变的频率低于50%，这表明存在另一种耐药机制。一项8例耐药患者的分析表明：

4例耐药患者存在一种以上TK结构域突变；
7例耐药患者的TK结构域突变除了存在FLT3-ITD等位基因中，也存在于天然FLT3等位基因中；
1例耐药患者的不存在任何天然或ITD FLT3等位基因突变。

这些发现共同表明，多种耐药机制在奎扎替尼（Quizartinib）耐药中发挥作用。

表3. FLT3抑制剂对突变耐药的活性

7.2非靶标相关耐药机制

由于奎扎替尼和索拉非尼是II型抑制剂，我们可以理解耐药克隆在FLT3基因的TK域获得性突变。与之相反，经I型抑制剂gilteritinib和crenolanib处理后的耐药克隆表现出不同于II型抑制剂处理后的耐药特征。

在接受吉瑞替尼（Gilteritinib）治疗的患者的遗传分析显示，有几种不同的克隆选择模式。在41名吉特替尼耐药患者中：

5名患者（12.2%）在接受吉替尼治疗后的AML细胞中未发现FLT3突变；但是，所有这些克隆中均发现RAS/MAPK途径突变，表明FLT3突变阴性克隆新获得RAS/MAPK途径突变并扩展为耐药克隆。
36例患者耐药克隆保留在最初的FLT3突变中。其中5例，FLT3‐F691L突变是在携带原始FLT3突变的耐药细胞中额外获得的。虽然FLT3-M837K和FLT3-C35S突变分别在一名耐药患者中被鉴定，但由于突变的FLT3不能诱导Ba/F3细胞的自主增殖，所以这两种突变都被证实是沉默的。
36例白血病细胞呈现持续性FLT3突变的患者中，有10例获得了RAS/MAPK途径突变，包括NRAS、KRAS、PTPN11、CBL和BRAF突变（表4）。

与quizartinib和sorafenib等II型抑制剂相比，FLT3额外突变的低频率可能反映了Gilterinib对FLT3-TKD的效力。值得注意的是，FLT3-F691L突变和RAS/MAPK途径突变是相互排斥的。

这些结果共同表明，吉瑞替尼（Gilteritinib）的非靶标相关耐药机制比II型抑制剂更常见。

表4.吉瑞替尼（Gilteritinib）和crenolanib耐药患者鉴定的非靶标基因突变

使用另一种I型抑制剂crenolanib治疗后，耐药克隆的特征也不同于II型抑制剂。在接受crenolanib治疗的患者中，治疗后残留的AML细胞中FLT3基因的获得性突变很少。50例接受克洛拉尼治疗的耐药患者中：

6例患者治疗后发现5种FLT3突变（D200N、K429F、Y572C、L601F和F691L），而D200N和L601F突变没有导致转化活性；
发现了一些表观遗传、髓样转录因子等相关的基因突变；
NRAS、STAG2、CEBPA、ASXL1和IDH2突变主要发生在FLT3突变无关的克隆中；
TET2、IDH1和TP53突变主要同时出现在FLT3突变克隆中（表2）。

8. 共价抑制剂

以前的研究共同表明，靶标突变耐药在使用II型抑制剂治疗的患者中经常发生，而靶标非相关的耐药经常发生在I型抑制剂治疗的患者中。

进一步开发新的FLT3抑制剂来克服FLT3门控残基（F691）突变是有必要的。

许多II型抑制剂被设计成有利地结合到FLT3的非活性构象的后袋，以增加对ATP结合位点的亲和力。相反，由于许多I型抑制剂被设计成只与ATP结合位点结合，因此它们可以与FLT3的活性构象结合；然而，由于激酶之间的结合位点相似，它们比II型抑制剂具有更广泛的激酶抑制活性。

为了解决这些问题，作者与FUJIFILM（日本神奈川）合作开发了一种新型FLT3共价抑制剂FF‐10101，其与FLT3的C695残基之间形成共价结合（图8）。FF-10101的这种共价键的形成诱导了对FLT3的不可逆抑制和有效的选择性抑制活性，并保持了对FLT3活性构象和非活性构象的结合能力。FF‐10101的独特结合还对各种FLT3突变，包括门卫突变F691L提供广泛而有效的抑制作用。