默克KIT抑制剂M4205的研发之路

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前言：

胃肠道间质瘤是最常见的影响胃肠道的间质肿瘤。而80-85%的胃肠道癌都是由KIT的突变引起的。KIT是Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族中的一员，突变型可以在没有相应受体的情况下，自磷酸化和二聚后引起下游信号的激活。大多数KIT突变位子在外显子9/11区域（胞外或近膜区域）。此前，治疗效果最好的一线药物是Imatinib，ORR（客观缓解率）为66%，PFS（无进展生存时间）为24个月。同时由于一线药物imatinib的长期使用，不可避免地出现了一些新的突变型——外显子13/14（ATP结合口袋）和17/18（激酶活化环），对应出现了Sunitinib等二、三线药物。但是这些药物的ORR和PFS都不是很理想。由于Ⅲ型受体酪氨酸激酶是一个较大的家族，这些药物同时也具有多靶点的作用，具有一定的毒性。本文旨在筛选优化出一种对三种突变型同时具有抑制作用，且选择性较高的KIT抑制剂。

Figure1 胃肠道癌治疗药物

如何有效筛选苗头化合物

文章首先用了高通量筛选，选出了对外显子13具有高抑制活性的先导化合物；然后再进一步筛选对FLT3（另一种Ⅲ型酪氨酸激酶）的选择性，最后得到苗头化合物1，对KIT ^V654A突变型的酶活性为12nM，且对FLT3等其他28种结构不同的激酶没有抑制作用。苗头化合物1对外显子11突变的GIST430细胞系，表现出了抑制Y703自磷酸化的高活性。这种活性同时也在外显子11/13突变的GIST430/654细胞系中表现。

文章选取了化合物2研究小分子与蛋白的共晶结构。图中看出，其咪唑并吡啶母核与Cys673和Glu671有氢键作用，母核上6位取代留有结合空间。苄型取代部分深埋在结合口袋内部，吡咯部分不参与极性相互作用。从其Phe811结合朝向看出，其结合模式为DFG-out非活性构象，为Type-II型抑制剂。

默克KIT抑制剂M4205的研发之路

Figure2 化合物2和32与KIT蛋白的共晶结构（PDB：7Z6Y;PDB:7ZW8）

通过合变换取代基,合理分析SAR，得到预期结果

1.保留蛋白小分子结合作用最强的核心部分，对Linker和结合口袋侧进行修改

进一步分析1-7 的SAR，化合物3、5、6、8替换了母核3位的吡咯和四氢吡啶部分影响了代谢稳定性，化合物2、4中，linker部分取代的甲基影响了苄型取代的空间构型，影响了化合物的活性。1、3、7相比，吡咯部分的改动的对酶活性影响不大，但是一定程度上影响了细胞活性；再看5、6、7、8，发现苄型取代部分对分子酶活性影响更大，联苯替换了原来的苄型取代，细胞活性提升一倍。

Figure3 化合物1-8

对母核6取代部分修改，以期获得较好溶解性和细胞活性

在明白Linker和深入口袋基团的SAR后，对可进一步修饰的母核6位取代部分深入探讨。9是引入一个供电子甲氧基，在其耐受、对酶活性影响不大的情况下，引入更大的供电基，得到10以期获得更进一步的结合，10的细胞活性进一步提升，但是溶解性差；11引入哌嗪增加水溶性。12在9的基础上用嘧啶替代了吡啶，用联苯替代了苄型取代部分，改善酶活性的同时，极大了增加了细胞活性。13用吡唑环取代了联芳环中的苯环，显著增加了代谢稳定性。在此前合理改动的情况下，最终得到了14这个化合物作为优化产物。

Figure4 化合物9-14

与1相比，14活性显著提升，对FLT3有一定抑制作用，但是在可接受范围内。同时对另外两种突变型的活性提升。hERG是指基因KCNH2，编码的蛋白质被称为Kv11.1，是钾离子通道的α亚基。抑制hERG会导致心脏毒性。1的hERG抑制率为90%，14为1%，意味着在母核6位的取代和末端R1替换为吡咯烷可以显著地降低化合物的hERG抑制作用，减少心脏毒性。

Figure5 化合物14、32和治疗药物

对各种KIT突变型的酶活抑制

深入探讨6位取代和联芳环对分子透膜率（外排率）、溶解度、代谢稳定性、心脏毒性的影响

为了进一步完善化合物的SAR，在14的基础上对母核6位的取代基类型和联芳环部分进行系统性研究。从CACO-2透膜性实验中看出，14透膜性很高且外排率低，但肠液溶解度只有2μg/ml，因此在R2引入碱性增溶基团。化合物18肠液溶解度上升50倍，但是透膜性减弱，外排率极高。 19、20的酶活性和代谢稳定性变差，心脏毒性减弱。21引入的是中性羟基增溶基团，增溶效果不明显。

默克KIT抑制剂M4205的研发之路

Figure6 化合物14-32

默克KIT抑制剂M4205的研发之路

Figure7 cLogP、pKa与外排率、hERG和FaSSiF之间的关系

根据上述结论继续优化，28、29透膜性和外排率中等，肠液溶解度中等，30、31透膜性差，这四种化合物都没有很强的hERG抑制作用。从这几个化合物的Log D和pK_a数据综合来看，强碱性和极性大的分子的外排率较高，强碱性和亲脂性的分子hEGR抑制率较高，弱碱性和中性分子肠液溶解度较低。

合理大胆选择PK较好的化合物，小心谨慎验证 “高”心脏毒性

32表现出很强的hEGR抑制作用，这与之前的结论相符合。但由于32表现出极高的肠液溶解度（374ug/ml），且其在所有化合物中具有低峰谷比的PK特征，降低了C_max引起副作用的风险，表现出良好的成药价值。

之后，通过几组体外心脏毒理实验，揭示32对于潜在的心脏副作用具有充足的用药安全窗口。

Figure8 14的PK参数

从共晶结构看(图2)，32相较于原来化合物2，延伸的联芳环结构通过一个水分子周围的残基有相互作用。与14对比，32对野生型KIT活性降低，对其他突变型活性大部分都是升高，选择性上升。在136个测试的激酶中，只有KIT (wt)和FLT3的结论率分别为65%和45%。进一步分析142种风险相关酶的脱靶效应(主要是细胞膜受体，酶，载体和离子通道)发现没有作用，也展示了较低水平的细胞毒性和神经毒性。同时，药物-药物相互作用 (DDI)也没有显示出风险。

M4205(32)显示出较强抑制体内肿瘤生长的效果，在35 mg/kg时剂量导致GIST430/654异种移植瘤消失(图9B)。此外，在小鼠中口服32后，在GIST430/654异种移植瘤模型中，观察到随时间依赖性和浓度依赖性的KIT自身磷酸化抑制(图9C和9D)。

该分子最终被命名为M4205，目前处于临床一期，属于MERCK公司。

Figure9 M4205的体内抑瘤模型

参考文献：

1. Blum, Dorsch et al. 2023.Blum, A., et al. (2023). “Identification of M4205─A Highly Selective Inhibitor of KIT Mutations for Treatment of Unresectable Metastatic or Recurrent Gastrointestinal Stromal Tumors.” Journal of Medicinal Chemistry 66(4): 2386-2395.

2. Sanguinetti, M. C.; Tristani-Firouzi, M. HERG Potassium.Channels and Cardiac Arrhythmia. Nat. 2006, 440 (7083), 463−469.

3. Wu, P.; Nielsen, T. E.; Clausen, M. H. FDA-Approved Small Molecule Kinase Inhibitors. Trends Pharmacol. Sci. 2015, 36 (7),422−439.

4. Lennartsson, J.; Rönnstrand, L. Stem Cell Factor Receptor/cKit: From Basic Science to Clinical Implications. Physiol. Rev. 2012,92 (4), 1619−1649.

5. Bauer, S.; George, S.; von Mehren, M.; Heinrich, M. C. Early and Next-Generation KIT/PDGFRA Kinase Inhibitors and the Future of Treatment for Advanced Gastrointestinal Stromal Tumor.Front. Oncol. 2021, 11, 2653.

封面图来源：网络