关注“药时代”微信公众号，获取更多精彩内容 ↓ ↓ ↓ 紧密连接（tight junction,TJ）是由多种蛋白组成的复合物，是上皮和内皮细胞最顶端的连接复合体。现已证明，有很多种蛋白质参与紧密连接的形成，主要由闭锁蛋白（occludin）、Claudin蛋白、膜周蛋白家族（ZO蛋白）以及连接黏附分子（junctional adhesionmolecule）等。Claudin蛋白参与构成的紧密连接结构在相邻细胞间的屏障功能、防护功能、增殖转化、转移抑制及细胞信号转导等方面均发挥重要作用。 Claudin是由CLDN基因所编码的一组蛋白质家族，目前在哺乳动物中至少发现了27个该蛋白家族成员，根据它们序列的相似性可分为经典和非经典的Claduins。经典紧密蛋白包括Claudins1-10、14、15、17、19，非经典紧密蛋白包括Claduins11-13、16、18和20-24。
一般而言，Claduins2、7、10、15、16通过在紧密连接上形成空隙增加细胞旁阳离子的渗透性，而Claduins4、5、8、11、14、18具有封闭作用。
Claudins具有相同的分子结构，由4个跨膜结构域、2个胞外环及细胞质内的氨基和羧基组成（图1）。在不同的Claudin之间，第1和4跨膜区以及细胞外环的氨基酸具有高度保守性，第1个细胞外环决定紧密连接的跨膜电阻和细胞旁通路的选择性，而紧密连接的结构与跨膜结构域及胞质部分有关。
Claudin蛋白的羧基端具有潜在磷酸化位点和PDZ（PSD-95/Dlg、/ZO-1）结合序列，磷酸化能调节其在紧密连接复合体中的定位，而PDZ结合序列使Claudin蛋白可与紧密连接膜相关蛋白的鸟苷酸激酶同及富含PDZ结构域的蛋白-1结合，在信号转导中发挥重要的作用。
Claudin蛋白是构成紧密连接的最主要的功能分子之一，几乎分布于人体的各个组织器管中。其功能主要为： 1.维持细胞极性及屏障功能：紧密连接存在于细胞上皮或内皮之中对于封闭细胞间的空隙有重要作用，其中Claudins与其它蛋白组成的连接复合体将细胞内外液体溶质区分，细胞外侧质膜被紧密连接功能性的分成顶侧的脂质部分和基侧的蛋白部分两个不同的功能区，并且阻止这两个不同功能区之间的相互弥散，从而形成了细胞的极性，其中JAM对于细胞极性的形成具有一定作用。 2.选择通透功能：Claudins可调节离子及大分子物质跨细胞旁路的被动转运，允许离子及小分子可溶性物质通过，并阻止微生物及毒性大分子的通过，从而维持细胞内环境的稳态。不同的Claudin亚型以多种组合方式构成不同的紧密连接复合体，以适应不同组织选择通透的差异性。
Claudin18.2（CLDN18.2）
CLDN18蛋白由CLDN18基因编码。CLDN18基因座上由于限制酶剪切位点的不同，导致首个外显子分成两种，分别编码2个不同的紧密连接蛋白CLDN18.1和CLDN18.2，并且有不同的细胞谱系定型，前者主要表达在肺组织，后者主要分布于胃组织。二者仅在第 1 个胞外结构域51个氨基酸的序列上存在8个氨基酸残基的差异（图3）。
图3：Claudin18.1和Claudin18.2结构差异 Claudin18.2的产品主要有四大类型分别为单抗、双抗、CAR-T和ADC布局管线梳理如下： Zolbetuximab是 全球第一种针对Claudin18.2单抗 ，在肿瘤细胞表面与Claudin18.2特异结合，从而引发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC），凋亡和抑制细胞增殖。Zolbetuximab为安斯泰来公司于2016年以14亿美元收购Ganymed公司。 1期研究共入组7例转移性胃腺癌和5例转移性胰腺癌患者，结果显示zolbetuximab安全性良好。11例可评估患者中，1例完全缓解（CR，胃腺癌），3例部分缓解（PR，2例胃腺癌，1例胰腺癌），5例疾病稳定（SD），ORR 为33.3%，中位PFS为130天。 2期FAST研究显示在CLDN18.2阳性胃癌患者中，和表柔比星+奥沙利铂+卡培他滨（EOX）化疗相比，使用zolbetuximab+EOX化疗可带来PFS的显著延长，两组中位PFS分别为7.5个月 vs 5.3个月（HR 0.44），且具有OS的显著改善，两组中位OS分别是13.2个月 vs 8.4个月（HR 0.56），两组ORR分别为 39% vs 25%。 2期ILUSTRO研究的队列2评估了zolbetuximab联合mFOLFOX6治疗CLDN18.2阳性晚期G/GEJ腺癌的疗效。19例可评估患者中，ORR达到63.2%，中位PFS为13.7个月，12月PFS率为58%。常见AEs为恶心和呕吐。3~4级AEs为中性粒细胞减少和粒细胞缺乏。 3期双盲安慰剂对照研究拟入组500名患者，患者1：1随机接受zolbetuximab+CAPOX或安慰剂+CAPOX治疗，目前正在进行中。ILUSTRO的队列3为zolbetuximab联合PD-1抑制剂帕博利珠单抗治疗CLDN18.2阳性晚期胃腺癌，目前也在进行中。 PM1032是普米斯自主研发并拥有完整知识产权的抗Claudin18.2/4-1BB双特异性抗体，有望用于胃癌、胰腺癌等肿瘤患者的临床治疗。PM1032在临床前相关研究中表现优异，现已获NMPA批准开展I期临床试验，是国产首款获批进入临床的Claudin18.2/4-1BB双特异性抗体。 LB1908是一款靶向 Claudin18.2（CLDN18.2）的CAR-T疗法 。CLDN18.2在胃癌、胰腺癌等癌症类型中表达，是目前抗癌药物开发的热门靶点。然而与它同源性很高的CLDN18.1在人体的肺组织中表达。这意味着，CAR-T疗法需要对CLDN18.2具有高度特异性，否则有可能攻击健康肺组织，导致严重毒副作用。
CLDN18.2与CLDN18.1的组织表达（图片来源：传奇生物官网） 目前，这款在研CAR-T疗法已经进入剂量递增1期临床试验。在首例接受最低剂量LB1908治疗的患者中，它表现出良好的安全性和初步抗癌活性。在接受治疗180天后，患者疾病稳定，而且在骨盆的肿瘤缩小15%，位于身体其它部位的病灶显著缩小，患者的生活质量也获得显著提高。
接受最低剂量LB1908治疗患者表现出临床缓解征兆 （图片来源：传奇生物官网） 康诺亚核心产品 CMG901（Claudin 18.2 抗体ADC） 用于治疗晚期胃癌及胃食管结合部腺癌获得美国食品药品监督管理局（FDA）授予的孤儿药资格认定（Orphan-drug Designation）。此前于2021年3月，公司获得美国FDA批准开展CMG901针对晚期胃癌及胃食管结合部腺癌I期临床试验。 临床前研究显示，CMG901能有效杀伤胃癌肿瘤细胞，其抗肿瘤活性远超zolbetuximab类似物及CMG901母本抗体，并展现出良好的耐受性及安全性。
Claudin1是紧密连接代表上皮或内皮细胞片中细胞间粘附的一种模式，在细胞周围形成连续密封，并作为物理屏障防止溶质和水自由通过细胞旁空间。这些连接点由向外的细胞质小叶中的一组连续网络链组成，在向内的细胞质外小叶中具有互补的凹槽。该基因编码的蛋白质是密蛋白家族的成员，是一种完整的膜蛋白，也是紧密连接链的组成部分。功能突变的丧失导致新生儿鱼鳞病硬化性胆管炎综合征。 claudin1在不同肿瘤中的基因表达、存活和通路相互作用分析 使用在线生存分析工具进行生存分析，以使用癌症基因组图谱(TCGA)数据集，评估CLDN-1表达对不同类型癌症生存的影响。 数据显示，CLDN-1的基因表达没有显著影响乳腺癌浸润性癌(BRCA)、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌(CESC)和胰腺腺癌(PAAD)(p>0.05)的生存率，但显著与甲状腺癌(THCA)、肾上腺皮质癌(ACC)、直肠腺癌(READ)(*p<0.05)（图4）生存相关。
图4：CLDN-1在各种癌症中的生存分析。
红线表示高表达，蓝线表示低表达。
(A)乳腺浸润性癌(BRCA)；(B)直肠腺癌（READ)；(C)宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌(CESC)；(D)甲状腺癌(THCA)；(E)肾上腺皮质癌(ACC)；(F)胰腺腺癌(PAAD)。
2022年1月4日，Alentis宣布完成 Claudin-1单抗ALE-F02 的临床1期试验首例健康受试者给药。 ALE-F02是一种高选择性抗Claudin-1（紧密连接蛋白1）单克隆抗体，可识别纤维化疾病中病理性过度表达和构象依赖性Claudin-1表位，通过调节非连接Claudin-1的功能，改变介导纤维化关键细胞的可塑性，预防并逆转肝和肾内纤维化组织生长。ALE-F02在临床前肝纤维化和肾纤维化模型试验中已显示出令人信服的安全性和有效性。Alentis将在1期临床剂量递增试验中对ALE-F02进行进一步研究。 2021年6月16日，Alentis Therapeutics宣布，公司在B轮融资中筹得6700万美元（6000万瑞士法郎）。这笔资金将主要用于Alentis靶向作用于Claudin-1的潜在“first-in-class”抗纤维化分子治疗晚期肝肾纤维化的概念验证临床试验，并为进行中的针对其他纤维化疾病和肝胆癌的药物发现项目提供支持。 Alentis Therapeutics是一家临床阶段生物制药公司，专注于发现和开发新的靶向疗法，该公司成立于2019年，公司的主要候选药物靶向Claudin1具有高度选择性的单克隆抗体。Claudin-1是一种新型靶点，具有独特的作用机制，在肝纤维化和纤维化驱动型肝胆癌的病理中发挥关键作用。 Claudin1靶向药物目前有ALE-F02处于1期临床研究、ALE-C04处于临床前研究 。
Claudin3是紧密连接代表上皮或内皮细胞片中细胞间粘附的一种模式，在细胞周围形成连续密封，并作为物理屏障防止溶质和水自由通过细胞旁空间。 这些连接点由向外的细胞质小叶中的一组连续网络链组成，在向内的细胞质外小叶中具有互补的凹槽。 这种无内含子基因编码的蛋白质是密蛋白家族的成员，是一种完整的膜蛋白，也是紧密连接链的组成部分。 它也是产气荚膜梭菌肠毒素的低亲和力受体，与大鼠中发现的推定凋亡相关蛋白具有序列相似性。
Claudin-3蛋白主要在细胞的细胞膜和细胞浆中表达，其中以在细胞浆中的表达为重，呈棕黄色或棕褐色。 其在正常卵巢组织组、良性卵巢肿瘤组、交界性卵巢肿瘤组和卵巢上皮性癌组中的阳性表达率依次升高，分别为10.0%、25.0%、45.0%、64.0%。（图3.2） Abion开发了全球首个靶向Claudin3的单抗ABN501，用于治疗乳腺癌和卵巢癌，目前处于临床前阶段。
Claudin6是紧密连接是上皮细胞或内皮细胞薄片中细胞间粘附的一种模式，在细胞周围形成连续的密封，并作为一种物理屏障，防止溶质和水自由通过细胞旁空间。 这些连接是由向外的细胞质小叶中的一组连续的网络链组成的，在向内的胞质外小叶中有互补的凹槽。 Claudin-6由上皮细胞表达，它参与组织发育和维持紧密连接的完整性。 它是丙型肝炎病毒的进入辅助因子之一。 CLDN6的甲基化可能参与了食管肿瘤的发生。 CLDN6基因与16号染色体上的另一个家族成员CLDN9相邻。
TJ-C64B是一款同时靶向肿瘤抗原密蛋白Claudin 6（CLDN6）和T细胞共刺激分子4-1BB的创新型双特异性抗体，用于治疗CLDN6阳性肿瘤。TJ-C64B可以通过与CLDN6结合条件性激活T细胞，从而提供更精准、高效的免疫系统激活，同时减少系统性毒性风险。目前，TJ-C64B正处于临床前研究阶段。
临床前研究数据表明，TJ-C64B具有独特的4-1BB结合表位，其仅在与Claudin 6结合的情况下才会刺激 4-1BB信号并产生抗肿瘤活性。这一独特的抗原依赖特性能够最大限度避免肝毒性及其他系统毒性。
在4-1BB人源化同源肿瘤小鼠模型中，TJ-C64B显示了强大的肿瘤抑制活性，同时观察到肿瘤浸润CD45+和CD8+T细胞数量以及CD8/Treg比值升高，提示TJ-C64B能够在肿瘤微环境中特异性激活免疫。
TJ-C64B重复给药后，肝酶ALT 及AST水平无显著变化，提示TJ-C64B无明显的肝毒性风险。
临床前研究数据证实了TJ-C64B独特的作用机理，并为其后续临床开发提供了坚实的基础。
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