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关于 Dr.X
日前，国家药品监督局（NMPA）向辉瑞公司开发的抗新冠口服剂 Paxlovid（奈玛特韦片/利托那韦片）予以条件性许可，用于成年伴有潜在重症风险的轻至中度新冠感染人群的治疗【1】。此前 Paxlovid 获得 FDA 上市许可之初，来自辉瑞的实验室数据显示， Paxlovid 对 Omicron 变异毒株依然有效。
自 2021 年 11 月于南非首次被发现，COVID-19 Omicron 因其传播快、传染力强等特征受到各方关注。关于 Omicron 极强的感染宿主细胞的能力，及逃逸中和抗体治疗的机制是学术界科学家积极探索的方向；同时，开发具有突变容忍度（Mutation-tolerant）的药物并建立快速有效的方法学是药物研发领域关注的焦点。
冷冻电子显微（Cryo-EM）作为当前结构生物学研究的最新技术，为基于结构的药物发现领域带来了突破。Dr. X 曾详细介绍了 Cryo-EM 技术基本理论方法及单颗粒分析方法的核心要点及实现高分辨率结构解析的具体应用案例（Dr. X | 冷冻电子显微技术—推动新型化药与抗体药发现）。结构是功能的基础，解析结构的最终目的在于探究作用机制。原子级高分辨率结构解析在揭示生物体复杂作用机制中的作用逐渐显露，为包括 COVID-19 病毒及多种变体结构在内的生物学研究做出了巨大贡献。本文将结合近期一系列研究，浅谈冷冻电镜如何帮助科学家揭示 Omicron 变体的独特作用机制，并指导新型抗体药物开发及理性设计的新方法。
SARS-CoV-2 病毒刺突蛋白 RBD 区域是中和抗体开发的重要研究靶标，因此不少研究从刺突蛋白结构入手。对 Omicron 刺突蛋白进行高分辨率结构解析，结果显示发生 37 个突变，其中 15 个位于 RBD 区域，数量均高于之前所有的 SARS-CoV-2 变体。
Omicron 刺突蛋白冷冻电镜结构并显示其突变位点。数据来源【2】
进一步利用冷冻电镜得到刺突蛋白 RBD-受体 ACE2 复合物的 2.66Å 密度图以分析两者结合面的氨基酸侧链时发现，Omicron RBD 区域的大部分突变原本造成二者结合亲和力的减弱；但表面的几个新出现的突变位点（Q493R, G496S 和 Q498R）与受体产生了新的盐桥和氢键，又很大程度加强了亲和力。该发现得到了其他研究组数据的支持：经测定发现与原始毒株 RBD 相比，尽管 Omicron 刺突蛋白 K417N 突变造成 ACE2 与 RBD 的结合降低了 3 倍，但 N501Y 突变却将结合亲和力提升了 6 倍之多【2】。总体来说，通过这样的“代偿机制”，使 Omicron 保持了与 Delta 相似的受体结合能力。
对比显示 Omicron 与 Delta 毒株 RBD-ACE2 结合界面高分辨率结构差异。
Omicron 产生的新突变（如 Q493R, G496S 和 Q498R）及 N501Y 和 Y505H 突变造成的局部结构改变形成了新氢键 (黄色虚线)和新盐桥（红虚线）。图片来源【2】
在面对 Omicron 时，多种靶向 RBD 的单抗均无法达到彻底中和的目的。这就为开发对关键结构具有较高容忍度的单抗药物提出了更高要求，目前全球已取得多项研究进展，如华盛顿大学医学院的科学家们开发了一款抑制广谱 sarbecoviruses 感染的新型抗体 S2K146【3】。冷冻电镜（3.2 Å）数据显示，S2K146 Fab 片段与 SARS-CoV-2 刺突蛋白的开放 RBD 区域结合模式，与刺突蛋白结合 ACE2 受体的模式几乎相同，从而达到有效减少感染的目的。这一设计思路与中科院上海药物所开发的广谱抗新冠抗体 JMB2002 不谋而合，JMB2002 抗体通过结合 Omicron 刺突蛋白 RBD，阻碍 RBD 与受体蛋白 ACE2 结合而发挥作用，在线发表于 2022 年 2 月 8 日 Science 杂志【4】。以上两种均为竞争性单克隆中和抗体，也有不通过竞争结合位点发挥作用的中和抗体，如 2021 年 12 月获得 NMPA 批准、由腾盛博药（Brii Bioscience）开发的安巴韦单抗和罗米司韦单抗就属于此类，通过抗体工程化以降低抗体介导依赖性增强作用的风险，并延长血浆半衰期以获得更持久的治疗效果。
Omicron 刺突蛋白三聚体与抗体 JMB2002 的结合模式。D，E 分别显 示RBD（1和2）与抗体 Fab 或 ACE2 结合的模式，表面抗体竞争性阻断了病毒与宿主受体结合的机制。F，左右两图分别展示了 Omicron L452 氨基酸残基与抗体 Fab 的结合，而 Delta 不能结合。G，基于冷冻电镜的抗原-抗体结合模式图显示，JMB2002 具有全新的抗原-抗体结合模式（黄色框），不同于既有认知的种类。
康复病人血清是开发新型的新冠治疗单克隆抗体药物的宝贵初始来源。高效识别新冠抗原特异性克隆并完成抗体的理性优化设计，是开发更优的单抗药物的思路。近期，一篇名为 “From structure to sequence: Antibody discovery using CryoEM” 的研究报道了一种融合冷冻电镜结构解析与二代测序的方法，无需获得稳定单克隆细胞株，基于康复病人血清多克隆 Fab 可变区（含 CDR 区）序列构建高效单抗的方法，全流程 如下所示【5】。
使用带有标记的抗原免疫动物，获取抗原免疫血清中的多克隆抗体进行抗原–抗体复合物结构解析，以确认其中关键的表位并构建包含该关键表位的结构模型。此时获得了复合物电子密度图，就需要根据密度确认氨基酸序列搭建正确的结构模型。而人工进行密度与氨基酸的逐一匹配、筛选出正确序列的流程相当耗时，尤其是在密度图分辨率不高的情形下，十分依赖研究人员的经验。为此，他们开发了基于密度图识别抗体序列的算法工具，提出了氨基酸指定系统（amino acid assignment system）。该系统整合了每个位置对应的氨基酸结构特征，根据是否为有序表面、亲水疏水性如何以及侧链形状等对氨基酸进行了多层次和分等级的扫描和归类。再利用同源建模，主要是对抗体重链和轻链的 CDR (complementarity-determining regions) 区域遍历式搜索最匹配局部密度的氨基酸类别或序列，获得初步预测序列；结合抗原特异性 B 细胞的二代测序结果为数据库，与初步预测序列进行匹配并打分，从而构建出满足局部关键结合位点以及整体框架特征的单克隆抗体结构模型。
冷冻电镜结构解析技术不仅为基于结构的小分子药物设计提供信息，在生物大分子药物开发中的重要应用逐渐得到认识。该技术能够在近原子分辨率下观测生物大分子的结构，特别是可视化的抗原–抗体结合模式，令抗体药物亲和力成熟、成药性改造、表位研究、作用机制的解析及工程化改造等应用更加有的放矢。冷冻电镜正以前所未有的方式改变结构生物学领域，帮助科学家实现一个又一个重大发现，为人类健康的探索助力。
【1】https://www.nmpa.gov.cn/yaopin/ypjgdt/20220212085753142.html
【2】D. Mannar et al. Science (2022). DOI:10.1126/science.abn7760.
【3】Y. Park et al. Science (2022). DOI:10.1126/science.abm8143
【4】W. Yin et al. Science (2022) Science(2022). DOI: 10.1126/science.abn8863
【5】A. Antanasijevic et al. Sci. Adv. 8, eabk2039 (2022)
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