【Nature子刊】PROTAC淘金热的背后：缺陷和风险

对小分子蛋白质降解剂的投资正在激增，但它们的缺点、局限性和风险正变得越来越明显。

7月，辉瑞向Arvinas支付了6.5亿美元的预付款外加3.5亿美元的股权投资，共同开发了一种处于II期临床研究阶段PROTAC降解剂。8月，拜耳以15亿美元的预付款和5亿美元的里程碑收购了Vilivion Therapeutics。去年，Kymera宣布与赛诺菲达成21.5亿美元的合作，一个月后上市，成为第三家上市的PROTAC公司。

目前，有四家PROTAC技术公司已经上市，累积市值达到110亿美元（截至11月底）。通过小分子降解疾病蛋白质靶点的诱人前景催生了至少十种其他生物技术。至少有六家公司的PROTAC样分子已经进入临床试验（表1）。

表1. 处于晚期开发中的代表性双功能降解剂

Company	Agent	Target	Indication	Stage
Arvinas	ARV-110	Androgen receptor	Prostate cancer	Phase 2
	ARV-471	Estrogen receptor	Breast cancer	Phase 2
	ARV-766	Androgen receptor	Prostate cancer	Phase 1
Bristol Myers Squibb (Celgene)	CC-94676	Androgen receptor	Prostate cancer	Phase 1
Kymera	KT-474	IRAK4	Atopic dermatitis, HS	Phase 1
	KT-413	IRAK4, Ikaros, Aiolos	MYD88-mutant DLBCL	IND 2H 21
	KT-333	Stat3	Liquid and solid tumors	IND 4Q 21
Nurix	NX-2127	BTK, Ikaros, Aiolos	B-cell malignancies	Phase 1
Nurix	NX-5948	BTK	B-cell malignancies	IND 2H 21
Dialectic Therapeutics	DT2216	Bcl-xL	Liquid and solid tumors	Phase 1
Foghorn Therapeutics	FHD-609	BRD9	Synovial sarcoma	Phase 1
C4 Therapeutics	CFT8364	BRD9	Synovial sarcoma, SMARCB1– tumors	IND 2H 21
C4 Therapeutics	CFT8919	EGFR L858R	NSCLC	IND mid-22
Cullgen	CG001419	TRK	Cancer	IND pending
Proteovant	NA	Androgen receptor	Prostate cancer	Preclinical
Proteovant	NA	Stat3	Cancer	Preclinical

PROTAC技术的潜力巨大。通过利用细胞自身的处理系统选择性降解目标蛋白质，PROTAC不仅可以消除不可成药的致病蛋白质，也有潜力克服传统小分子的耐药性。但他们能否成熟成为一种新的药物研发技术，还不是板上钉钉的事情。随着PROTACs研究的增多，其局限性已经开始显现：它们比传统的小分子更难开发，它们不容易降解多种类型的蛋白质，其毒理学尚不确定，副作用也基本未知。

PROTAC公司C4 Therapeutics的联合创始人、斯坦福大学有机化学家纳撒尼尔·格雷（Nathanel Gray）说：“未来几年将是该技术的关键之年，人们希望看到临床上的成功，并在这一领域进行再投资。如果成功，这一领域就可以像生物制品一样发展，因为一些抗体研发已经成为一种通用模式。但要预测能否成功还为时过早。”

一鸣惊人

PROTAC，通过劫持细胞的泛素-蛋白酶体系统（UPS），实现靶蛋白降解。小分子的一端与E3泛素连接酶结合，另一端由连接体连接，连接到感兴趣的蛋白质靶点。PROTAC使连接酶与靶标接触，触发泛素链的转移并标记靶标以在蛋白酶体中处置（图1）。PROTACs的灵感来源于诱导接近的化学生物学概念，即自然界中的某些小分子可以通过使两种蛋白质紧密接触而产生深远的影响。耶鲁大学化学生物学家克雷格·克鲁斯（Craig Crews）和加州理工大学生物化学家雷·德沙伊斯（Ray Deshaies）在2001年描述了第一个功能性PROTAC。

图1.PROTAC分子的模式图

由于最初使用了体积庞大的肽类E3配体，因此直到2015年，PROTACs仍然是一个创新的想法，没有太多实际应用或商业利益。那一年，克鲁斯和同事们报道了具有纳摩尔效力的小分子PROTACs，以及招募cereblon E3连接酶的PROTACs。当时供职于达纳法伯癌症研究所的肿瘤学家杰伊·布拉德纳（Jay Bradner）（现任诺华生物医药研究所所长）和他的团队也报告了一种选择性和有效的cereblon招募PROTAC。这些论文在该领域引起了轰动，因为他们将免疫调节酰亚胺（“IMiD”）药物、沙利度胺及其衍生物用于E3配体招募，这些药物是临床在用的重磅炸弹药物。

机遇与困难

但制药公司很快就遇到了问题。对于PROTACs来说，仅仅使E3接近靶蛋白是不够的；必须以三元复合物的形式结合在一起，然后必须触发泛素化。但泛素化并不总是诱导靶降解。而且，由于PROTAC设计的规则在很大程度上仍然未知，靶蛋白结合亲和力不能预测活性，因此PROTAC的发现在很大程度上仍然是经验性的。格雷说：“这也是为什么必须进行所有此类药物化学的原因。因为生产临床级PROTAC降解剂的公司通常需要合成数千种化合物。”这种努力需要时间和劳力，而且代价高昂。

现在，合成PROTAC工具化合物相当简单。对于许多靶蛋白，“我们可以在几周内得到一个相当好的降解物，”密歇根大学化学学家王少萌说。“我不会说这完全是一场猜谜游戏。”但真正的瓶颈是解决PROTAC的口服生物利用度。与典型的小分子相比，它们具有更高的分子量（0.7–1.1 kDa）、更多的氢键供体和更大的极性表面积，所有这些因素都会影响肠道通透性。

公司正在生产口服生物可利用的PROTACs，但要付出时间和精力的代价。“低渗透性，低溶解度，这是普遍存在问题”Arvinas’Taylor说。

C4采用基于酶学的方法来加速PROTAC优化。在hit鉴定阶段，生物学家就推导出药物的动力学常数。然后，模拟或测量的药代动力学数据。随着该公司对降解剂经验的增长，告诉化学家分子的哪些部分对推动其降解效率很重要，以及如何改变以使其更好。

C4还形成了大量的cereblon粘合剂，它可以在给定化合物中来回切换，以提高其降解活性。C4 CSO Stewart Fisher说：“仅仅改变cereblon粘合剂，我们经常看到截然不同的动力学或降解活性”。不幸的是，预测一个给定的粘合剂对分子的影响仍然是“在这个阶段主要是经验性的，”费舍尔说。“但是……我们在平台的设计部分正在取得进展，”正在进行三元复杂建模。然而，这种模型仍然无法确定哪种三元络合物最适合降解。这是最终目标。”格雷说：“我不知道这是五年后还是十年后，但很可能会到来。”

因此，尽管各公司在一定程度上提高了PROTAC的优化过程，但这在很大程度上仍然是经验性的，而且比抑制剂更难。格雷说：“对于公司来说，这是一个非常重要的提升。他们中的许多人得出结论，除非他们真的需要降解剂来了解药理学特性，否则他们宁愿投资于其他东西；因为获得一个临床候选物非常困难。”

高剂量

PROTAC的一个理论优势是低剂量，因为PROTAC驱动的降解是“事件驱动的”，而不是“占用驱动的”：只需要瞬时靶标绑定。在结合和泛素转移后，药物解离并以酶的方式转移到下一个靶点。临床前，极低剂量的PROTAC可显著降低蛋白质水平。

Arvinas的二期药物是口服生物利用的，但其雄激素受体降解剂ARV-110的二期剂量为420毫克，该公司的雌激素受体降解剂剂量为200毫克和500毫克。为什么是高剂量？泰勒解释说，低渗透性和溶解性。“药片中有相当数量的药物，但并不是全部被吸收，”他说。“剂量似乎很高，但……不需要那么多化合物被吸收，进入细胞就可以产生降解效果。”高剂量意味着更高的制造成本，而PROTAC由于其多步骤合成，制造成本已经很高。

使用低剂量应该是可能的。Wang为ProteoVant开发了一种雄激素受体降解剂，他声称这种降解剂比Arvinas的更有效，与血浆蛋白的结合更少。如果能增加药物的游离部分，就可以减少人体剂量。Nurix的I期临床阶段的BTK降解剂在非人灵长类动物中有效，剂量低至每千克体重1毫克（人体剂量尚未披露）。Nurix首席执行官亚瑟·桑兹（Arthur Sands）声称：“我们已经克服了这些（剂量）问题。”

但口服生物利用度是PROTAC发展的瓶颈。大多数公司正在使用cereblon而不是von Hippel–Lindau（VHL）E3连接酶开发口服降解剂，尽管基于VHL的PROTAC更容易制造。cereblon粘合剂具有更好的“类药物”性质——较低的分子量、较少的氢键供体和较少的可旋转键。这些特性使得基于cereblon的PROTAC更小、更灵活，因此比基于VHL的PROTAC更容易通过肠膜。“我们使用VHL配体来开发研究工具，但我们真正关注的是使用cereblon配体来发现化合物，将其纳入临床开发，”Wang说。

分子胶

鉴于PROTACs的剂量和口服可用性挑战，一些公司正在集中使用另一种降解剂：分子胶。这些是仅结合E3连接酶的“单价”小分子，与结合连接酶和靶点的二价蛋白相反。来那度胺就是一个典型的例子。

当一种分子胶附着到E3连接酶上时，它会改变酶的表面以招募目标蛋白，从而导致目标蛋白的降解。例如，来那度胺触发cereblon降解Ikaros和Aiolos转录因子，可以用于多发性骨髓瘤的治疗。

分子胶的缺点是很难理性设计分子，针对选定的疾病相关靶标进行降解。分子胶的发现必须反向进行，筛选E3结合分子以获得所需的表型，或针对大型蛋白质组进行筛选，然后找出它们正在降解的蛋白质。克鲁斯说：“我不认为有一种简单的方法可以使分子胶以一种主动的方式瞄准一种特定的感兴趣的蛋白质。”。但许多公司，包括百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb），在2019年以740亿美元购买了Celgene及其IMiD药物及其分子胶管道。

副作用

毒理学是PROTAC发展的另一个瓶颈。存在潜在的靶向和非靶向副作用。靶向效应包括降解整个蛋白质的意外后果。“从组织中去除一种蛋白质与仅仅与之结合并抑制其功能相比具有完全不同的结果，”王说。“您确实需要选择一个通过降解方式不会给您带来不可接受毒性的靶标。”Nurix依靠遗传学进行安全的靶标选择：敲除目标蛋白必须导致干净的表型。

当然，完全去除蛋白质也比仅仅抑制更有效，因为很多蛋白质具有抑制剂不能触及的支架功能。但这是一个危险的优势。C4的费舍尔说：“这种降解方式非常强大。如果你将其应用于任何给定的靶标，你将看到这种力量的影响。”C4通过BRD4的降解物吸取了这一教训，该化合物本来及计划于2018年进入临床，但在2017年被放弃。

格雷说：“一些公司已经明确地发现，某些激酶抑制剂的降解产物的毒性更大。要么是因为消除蛋白质会产生更严重的后果，要么是因为该化合物的某些非预期靶标。”

目前，脱靶的影响主要是理论上的，但公司正在关注它们。PROTAC弹头通常对其靶标具有极高的特异性，甚至比给定的抑制剂更具特异性。“如果你瞄准特定蛋白质的弹头相当干净，你可以得到一个非常有选择性的降解剂，”王说。问题出在E3连接酶端，因为如果E3以类似IMiD的方式与PROTAC对接，PROTAC会降解意外底物，就像来那度胺处理后cereblon对Ikaros和Aiolos所做的那样。费舍尔说：“我们在临床上投入的每一位候选人都没有IMiD活动。我们不知道cereblon能做什么，也不知道它是否发生在某个组织中。因此，在这方面，我们面临着风险。”

C4和Arvinas进行了全细胞蛋白质组学研究，以检测PROTACs正在降解的蛋白质，但这些筛选并不全面，无论是在所调查的蛋白质还是所使用的细胞系方面。格雷说：“这种方式确实有些可怕：在一个组织中降解的东西在另一个组织中可能非常不同，真的必须从临床前毒理学的角度来考虑这个问题，一些下游降解物效应可能不会出现在蛋白质组学中。”

靶标受限

PROTAC可降解的蛋白质也一定程度受限。降解剂公司Casma Therapeutics的CSO Leon Murphy说：“我通常没有见过很多ProTAC降解膜蛋白的例子；我的感觉是跨膜蛋白可能不是PROTAC的正确靶点。”“如果靶点是一个完整的膜蛋白，几乎没有任何东西暴露在细胞质中，你不可能首先抓住它，也不可能携带泛素。因此，这可能是难以解决的。”

具有扩展重复序列和聚集的蛋白质也有问题。Murphy说：“15年来，人们已经知道自噬可以降解易聚集蛋白，并且比泛素-蛋白酶体系统更有效。”。“因此，如果你同意的话，这肯定是一组不适合蛋白酶体降解的靶点。”

Casma正在开发溶酶体和自噬途径降解剂。溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）将靶向抗体与触发溶酶体降解的聚糖连接，自噬靶向嵌合体（AUTACs）将靶配体与自噬降解标签连接。

几家初创公司最近进入了非UPS降解领域。Murphy说：“试图利用自噬溶酶体途径的公司数量激增，主要是因为有一系列靶点不会被PROTACs降解。”劫持自噬的降解物也可以降解整个细胞器，这与PROTACs不同。墨菲说：“蛋白酶体不可能降解线粒体、过氧化物酶体或脂滴。”。

当然，如果PROTAC在临床上取得重大成功，那么开发瓶颈和靶标限制对制药公司和其他投资者来说不会有多大影响。格雷说：“这取决于这些试验的进展情况，它将决定这是PROTAC的一个格列卫时刻，还是将萎靡不振并等待一段时间。”

文献：Nat Biotechnol. 2021 Dec 14. doi: 10.1038/s41587-021-01173-2

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