紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

从新冠病毒检测窥见恒温核酸扩增技术发展!

随着欧美新冠病毒检测试剂产能的大幅增加,新冠病毒感染者确诊数不断飙升,美国确诊已经突破14万。 全球确诊患者超过67万。

当传染性疾病进入一个地区、一个国家,甚至是全球蔓延时,迅速进行诊断是重中之重,也是相对容易做到的。

雅培的5分钟快速诊断技术ID NOW COVID-19最近获得FDA紧急授权使用,将检测速度做到了极致,而准确性也不打折扣,可以极大缓解疑似病例的数量,特别对医护人员是个极大的利好。

这里简单比较一下新冠病毒几种不同的检测技术,重点讨论恒温核酸扩增技术及雅培的5分钟检测技术的来龙去脉。

谁是新冠病毒检测的金标准?

体外扩增技术聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction,PCR)具有特异性强,灵敏度高等优点,是目前应用最为广泛的核酸体外扩增技术。也是新冠病毒测试的金标准。而基于荧光技术的定量,实时PCR(qPCR, RT-PCR),已经取代传统的PCR方法,成为这次新冠病毒检测的主流。中国迄今为止批准了19个紧急授权使用的试剂检测产品,其中核酸检测试剂11个,抗体检测试剂8个。而核酸检测中的9种是荧光RT-PCR技术。

抗体检测现在属于间接检测试剂,分为病毒抗体检测和病毒抗原的检测。抗体检测试剂是检测血清中由病毒进入人体后刺激人体产生的IgM或IgG抗体,IgM抗体出现较早,IgG抗体出现较晚。病毒抗原检测主要是检测病毒表面的一些蛋白质如spike。抗体检测现在不能作为主要确诊方法,只能用于辅助诊断。

2月初,武汉大学中南医院的张笑春教授因“核酸检测特异性高、敏感性偏低,不排除存在部分假阴性”,而强烈建议将CT影像作为首选诊断方法。但钟南山团队在国际顶级医学期刊《新英格兰医学杂志》最新发表的论文指出,确实存在部分核酸检测阳性、有临床症状但入院时无任何影像学异常表现的新冠肺炎患者,且非重度患者中这类患者比例远高于重度新冠感染患者,所以CT影像不宜作为标准检测方法,可以作为辅助检测手段。

1.  部分中国国家药监局应急审批新冠病毒检测试剂清单

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

美国FDA也已经批准了20种紧急授权使用的新冠病毒诊断产品。最早获批使用的CDC的RT-PCR技术是2020-2-4,仅比中国的试剂盒获批时间晚了9天,但接下来的20几天,CDC集中统一管控测试的办法检测周期过长,效率非常低下,试剂盒数量远远不够,质量也有问题,浪费了大量宝贵的时间窗口。直到罗氏3月12日,赛默飞3月13日的核酸试剂盒获批,才开始逐步缓解了试剂盒的缺口。直到现在,新增确诊患者的瓶颈依旧是试剂盒的检测产能。

美国获批的试剂盒多数属于荧光RT-PCR技术,需要一天到几天才能确诊。而最新雅培获批的ID NOW COVID-19试剂盒则使用全新的恒温核酸扩增技术(Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques, Iso-NAAT,INAAT)。表中我们比较了传统的PCR,RT-PCR,与INAAT的优劣势。Iso-NAAT最大的优势是又快又准,最大的劣势是不易高通量检测,像ID NOW虽然快,但一次只能测一个样。

2. 美国FDA应急审批新冠病毒检测试剂清单

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

3. 不同核酸分子诊断技术的优劣势比较

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

恒温核酸扩增技术的原理是什么?

PCR技术虽然特异性强,灵敏度高,但需要热循环仪。热循环仪体积大、价格较高,使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。

20世纪90年代初,研究人员尝试创新开发无须热变性的恒温核酸扩增技术,并挖掘其在各领域应用的潜力,试图掀起核酸扩增技术的新革命。

等温扩增技术的基本原理和反应成分各不相同,本质上要解决的核心难题是使新合成的DNA模板退火变性进而引发进一步的扩增反应。等温扩增技术流行的一种分类方法是可以分成两类,第一类是扩增反应依赖于特异性引物延伸;第二类是扩增反应依赖于限制性内切酶。

第一类包括:

  1. 1991年由Compton等提出的依赖核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA),主要依赖AMV逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶和一对引物来完成等温扩增;
  2. Fire等于1995年首次提出借鉴微生物环状DNA复制过程的滚环扩增技术(Rolling circle amplification,RCA)。在RCA反应中,phi29 DNA聚合酶是至关重要的组成部分,具有持续DNA合成能力和链置换活性;
  3. Notomi等于2000年开发环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。LAMP使用4条引物,特异性强、录敏度高检测下限可达几个拷贝。
  4. Vincent等2004年等提出依赖解旋酶扩增技术(Helicase-dependent amplification,HDA)。
  5. Piepenburg等参照了T4噬菌体DNA复制系统于2006年创建了一种新型的等温扩增技术,使用酶来打开双链DNA,该技术称为重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)。RPA引物设计简单;灵敏度高,最低能检测出仅含一个拷贝的样品,但反应条件苛刻,不适合检测粗样品。
  6. Wharam等于2001年创建了依赖RNA转录的信号介导RNA扩增技术(Signal-mediated amplification of RNA technology,SMART)。SMART不是通过增加靶序列拷贝数实现检测,而是通过信号的放大来进行。
  7. Kurn等于2005年首次报道单引物等温扩增技术(Single primer isothermal amplification,SPIA)。该技术主要通过使用一条嵌合引物“5′-RNA-DNA-3’”、RNase H和具有强链置换活性的DNA聚合酶来实现核酸等温扩增。

第二类包括:

  1. Walke团队于1992年首次报道的置换扩增技术(Strand displacement ampli-fication,SDA),此方法的建立标志着一种新型DNA扩增技术的诞生。SDA反应全过程主要依赖于限制性内切酶对半硫代磷酸化碱基对应互补链的切割作用,以及聚合酶exo-klenow对切口的延伸作用和对下游DNA片段的置换作用。
  2. Van Ness等于2003年开发了指数扩增反应(Exponential amplification reaction,EXPAR)。该技术利用扩增模板合成寡核苷酸,长度为8-16 mer。反应试剂中的BstNBI切口酶在反应中发挥着至关重要的作用,因此,也可以把该技术称为切口酶扩增反应(Nicking enzyme amplification,NEAR)。雅培的ID NOW就是应用的这种技术。
  3. 2006年研发切刻内切酶介导等温核酸扩增技术(Nicking enzyme mediated amplification,NEMA)。NEMA反应体系中使用一种能够识别特异性的位点并发生自然单链切割产生缺口的切刻内切酶。切刻内切酶的使用克服了传统SDA反应中需要添加化学修饰的非标准核苷酸的缺陷,简化了反应体系,提高了反应效率,成本更低,并且可合成长链DNA。

值得一提的是,近日(2020-2-15),麻省理工学院张锋团队发布新冠病毒SHERLOCK CRISPR检测技术,称采用等温扩增技术RPA,有望一小时内实现病毒检测。检测步骤分三步:1. 提取样本中的核酸后,对其进行42摄氏度、25分钟的等温扩增;2. 样本中加入Cas13蛋白、向导RNA和探针,在37摄氏度下反应30分钟;3. 用试纸检测处理好的样本,大约需2分钟。

本来RPA核酸扩增荧光标记后即可直接电泳检测产物,没有看出再引入步骤2的必要。第一步还需要核酸提取,不如ID NOW一步到位有优势。

4. 不同恒温核酸扩增技术比较

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

谁是更好的恒温核酸扩增技术?

荧光RT-PCR技术大同小异,而恒温核酸扩增技术实现的方式却各不相同。那么谁是更好的恒温核酸扩增技术哪?现在还是群雄战国时代,尚无法下结论,只能从它们的市场表现来发现些许倪端。

从2016年的市场份额来看,TMA和LAMP各占约15%的份额,NEAR(EXPAR)占9%份额,其它的技术也各有一席之地。

到2018年,NEAR发展最快,份额接近三分之一。TMA技术份额下降明显。

2019年恒温核酸扩增技术的市场总额达到19亿美元。预计年复增长率在11%左右,2024年可达到33亿美元。

1. 不同恒温核酸扩增技术市场份额比较

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

雅培ID NOW Covid-19 检测为什么5分钟出阳性结果,13分钟才出阴性结果

ID NOW的技术最初由圣迭戈的初创公司Ionian开发,2010年被Alere收购。后来Alere在2016年以58亿美元被雅培收购。

2. ID NOW COVID-19 的技术原理

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

雅培的ID NOW使用的是EXPAR指数扩增反应,也叫NEAR,切口酶扩增反应技术。它最大的特点是合成产物为寡核苷酸,序列最短,平均只有8-16个碱基,它也是最快的技术。

EXPAR指数扩增能否顺利开展,取决于触发反应。而最简单的一种机制是依赖基因组DNA上存在的切口酶的识别序列。切口酶切割单链基因组DNA识别序列,缺口下游带有3’悬挂的DNA序列,能在60℃下自动解离,同时上游DNA序列以触发模板为模板,在DNA聚合酶的作用下开始延伸,合成平末端的DNA序列。

与此同时,新形成的识别序列再次被切割,缺口下游的DNA序列自动解离,成为触发子。上游DNA序列继续延伸,切口酶继续切割,从而线性生成触发子,反应进入指数扩增阶段。在这个过程中,每个双链DNA也会线性生成单链片段,从而达到指数扩增的目的。

EXPAR发展至今,已被广泛应用于检测蛋白质和DNA。EXPAR的主要优点在于:反应稳定性好,速度快,灵敏度高。但由于反应机制复杂,产物产量易受扩增模板限制,使得后期会从指数扩增转变为线性扩增。

由于ID NOW COVID-19的检测方法采用实时荧光技术,当荧光强度达到一定阈值,即可判断样品为阳性,而最快达到阈值的时间约为5分钟。如果5分钟时荧光阈值尚未达到,则反应继续进行,只要在5-13分钟之间扩增产物荧光强度达到阈值,仍旧为阳性样品,如果直到13分钟尚未达到荧光阈值,则视为阴性样品。ID NOW检测COVID-19的下限可达几百个病毒拷贝,无需核酸提取,能够做到又快又准,缺点是不能高通量,一次只能测一个样品。

ID NOW仪器售价约为8000-10000美元。从ID NOW检测获益最大的应该是基层私人诊所、急救中心等需要尽快得知检测结果的地方。同时,加州还有5万多疑似病例,不能及时确诊,对医护人员也是巨大的威胁,ID NOW COVID-19普及使用应该可以加快确诊速度。

恒温核酸扩增技术会革了RT-PCR的命吗?

等温核酸扩增反应的优势正逐渐取代传统的RT-PCR聚合酶链式反应,已经在临床医学、检验医学、分子生物学、水和食品安全等不同领域中的发挥着重要作用,特别是在致病菌、病毒等传染微生物的检测中。

但恒温核酸扩增技术与RT-PCR技术有着很强的技术互补性,短时间内从市场表现看还不能超越RT-PCR技术。

2019年恒温核酸扩增技术的市场总额为19亿美元,而RT-PCR技术市场总额达到36亿美元,接近常温核酸扩增技术的两倍。即使常温核酸扩增技术的年复增长率比RT-PCR高,但并不能取代后者。

同时RT-PCR的优势在于中心实验室的高通量测试,而恒温核酸技术更擅长即时快速检测(point of care)。二者的互补性多于竞争性。

3. RT-PCR与恒温核酸扩增技术的市场及增长率比较

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

小结

根据新冠病毒的诊断结果,可以采取必要的隔离措施,以防止病毒传播并及时对患者进行治疗。中国,韩国在诊断与隔离都做出了表率。但由于种种原因,严格隔离在欧美难以实现,所以检测诊断的作用在美国大打折扣。

检测、隔离是抑制新冠病毒蔓延的第一步,在疫苗与治疗药物到来之前,也是目前最有效的一步。

可以预见,在不久的将来,新冠病毒检测的产能很快就会过剩,疫苗和治疗药物却还遥遥无期。 为己为人,实施社交远离或强制隔离,检测才会效益最大化。

 

参考文献:

  1. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Jeffrey Van Ness, Lori K. Van Ness, and David J. Galas Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 15; 100(8): 4504–4509.
  2. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Manmohan Parida1, Santhosh Sannarangaiah, Paban Kumar Dash, P. V. L. Rao and Kouichi Morita. Rev. Med. Virol. 2008; 18: 407–421.
  3. 核酸等温扩增技术在微生物快速检测中的研究进展. 王大洲, 郭天笑, 郑实, 商颖, 许文涛.. 生物技术通报, 2017, 33(7): 49-61
  4. Current and Future Perspectives on Isothermal Nucleic Acid Amplification Technologies for Diagnosing Infections. Infect Drug Resist, 13, 455-483 2020 Feb 12 eCollection 2020
  5. https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-authorizations#covid19ivd

紫薯博士专栏 | 新冠病毒诊断检测技术小结

发布者:药时代,转载请首先联系contact@drugtimes.cn获得授权

发表评论

登录后才能评论
分享本页
返回顶部