谢雨礼博士 | AMG 510只是攻克RAS的一小步

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谢雨礼博士

2019年中秋节

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回顾今年的行业热点，小分子药物的热度在免疫疗法的喧嚣过后似乎有所回升，其中最大的亮点就是安进公司的KRAS G12C小分子抑制剂AMG 510。继ASCO后，9月中旬安进在巴塞罗那的WCLC大会上更新了AMG 510的一期临床数据：携带KRAS G12C突变的非小细胞肺癌病人中，960mg高剂量组ORR达到54%，疾病控制率100%，未见明显毒副反应。考虑到这些病人都是经过重度治疗的，这个数据算是比较靓丽的。其实业界感到兴奋，可能并不是因为这个数据有多好，而是RAS这个被认为不可成药的致癌基因之王，经过30年努力，其直接抑制剂第一次接近成功。

直到1974年，UCSF的J. Michael Bishop和他的博士后Harold Varmus通过DNA探针意外发现未被感染的正常细胞中也存在此前RSV病毒中发现的肿瘤基因src。原来肿瘤基因早就存在于宿主的基因组当中，远古时期，病毒从宿主细胞中获得这些基因片段并加以改造，也就是说病毒所携带的肿瘤基因其实来自我们自身。这些发现打开了以基因变异为基础的现代肿瘤生物学的大门。Bishop和Varmus也因此在1989年获得了该领域的第三个诺贝尔奖。

Harvey和Kirsten等人在60年代分别发现了类似于RSV的逆转录病毒携带的老鼠肿瘤基因HRAS和KRAS（1，2）。1982年，Weinberg等实验室在人类膀胱癌细胞T24/EJ中也发现了HRAS，使得RAS成为第一个被发现的人类肿瘤基因（3）。50多年过去后，RAS基因被发现是肿瘤中最常见的突变基因之一，30%的肿瘤携带RAS变异，如果算上RAS调控因子和信号通路上下游的变异，几乎覆盖所有肿瘤，RAS变异每年造成一百万以上的病人死亡，无愧是肿瘤基因之王。这也令人非常好奇，RAS到底具有什么神奇功能，令肿瘤细胞如此依赖？

谈到RAS的致癌功能，又要提起肿瘤发生机制的主要假说SMT（Somatic Mutation Theory）。该理论认为肿瘤来源于正常细胞，基因突变的驱动下，获得生存优势，不断进行适者生存的进化，最后演变成具有基因组不稳定、无限增殖和抗凋亡等十大标志的肿瘤细胞。这十大标志或者说能力都服务于肿瘤细胞的唯一目标：无限复制而获得永生。细胞的复制开始于休止期（G0），接收生长因子信号的刺激后，启动分为四个阶段（G1、S、G2和M）的细胞分裂周期。在这个周期中，母细胞一分为二，复制基因并均等地分配给两个子细胞。肿瘤基因突变或者异常可以驱动生长因子信号失控，造成细胞不受控制的生长和分裂。如图2所示，RAS处于各种信号通路的中枢位置，下游控制的通路包括Raf、PI3K和RalGDS等。RAS在分子水平上可以调控蛋白质的合成、基因转录等过程；细胞水平上影响细胞形状、生长、分化、凋亡、转移等等。生长因子受体EGFR、FGFR，以及转录因子Myc的变异也能驱动肿瘤的形成，RAS既可以在这些肿瘤基因的下游传递放大信号，也可以反馈增强它们的致癌功能。

如果肿瘤基因突变就轻易导致肿瘤，物种进化就不会保留它们。事实上，肿瘤的发生还需要对抗肿瘤抑制基因的作用。正常细胞的生长、分裂和增殖是由复杂信号网络所严格控制的。比如细胞周期中，遗传物质复制出错就可能被中止分裂。细胞周期中有一个重要节点叫做限制点（R point），处于G1期的中后段，细胞分裂一旦越过R点，就无法停止，即使没有生长因子的存在，细胞分裂也会进行到底。控制这个R点的关键基因叫做pRb。在CDK/Cyclin的调控下，磷酸化的pRb通过控制转录因子E2F决定细胞周期是否可以越过R点。pRb是限制细胞不正常分裂的最重要的检查点，自然也是至关重要的肿瘤抑制基因。与RAS一样，几乎所有肿瘤中，pRb的正常功能一定程度被干扰。另一个与pRb同等重要的肿瘤抑制基因是监控细胞健康状态的转录因子p53。正常细胞一旦受到破坏，p53会中止细胞的生长和分裂，启动修复机器，如果无法修复则启动细胞凋亡程序。生长因子失控或者是pRb功能缺失，也会导致p53介导的凋亡。大量突变和功能异常的肿瘤细胞如果希望永生，必须摆脱p53的控制，因此p53的loss-of-funtion突变出现在三分之一的肿瘤之中，加上其相关通路的异常也是几乎覆盖100%的肿瘤。

这样，RAS过度激活以及pRb和p53功能丧失成为导致肿瘤的三座大山，它们是目前发现的肿瘤中突变最多的三个基因。这也说明它们处于肿瘤细胞信号网络的最关键节点上。广义上说，绝大多数靶向药物的靶点都处于这三个基因调节的信号通路中，比如EGFR、Braf、MEK、ERK、PI3K、Akt、mTor、CDK4/6、Parp、TGF-beta、Bcl-2和Mdm2等等。俗话说擒贼先擒王，十分遗憾目前还没有直接靶向这三个靶点的药物出现。从生物学的角度上看，pRb和p53是肿瘤抑制基因，功能异常经常体现在蛋白缺失或者功能被抑制，难以用药物进行干预。近年来，也有人尝试用小分子纠正变异p53的构象，恢复其野生型的功能。相关药物APR-246和COTI-2已进入临床研究，但进展缓慢，有效性仍未得到验证。乍一看，RAS相对于pRb和p53，作为异常激活的肿瘤基因，是更加理想的药物靶点。事与愿违，经过多年的探索，RAS被认为是不可成药靶点，攻克RAS成为制药界的哥德巴赫猜想。

为什么RAS长期以来被认为不可成药？这要从其结构，工作原理和调控机制说起。RAS主要有三个亚型HRAS、KRAS和NRAS，其中KRAS通过RNA剪接又表达两个不同的蛋白KRAS4A和KRAS4B。RAS蛋白是一种21kDa大小，位于细胞膜上的，拥有GTPase酶活性的鸟嘌呤核苷结合蛋白。如图2所示，RAS是GDP/GTP循环控制的二进制分子开关：GDP结合时处于“关”的状态，而GTP结合则代表“开”的状态。没有刺激信号时，这种关开状态的转换非常缓慢。接收到信号后，鸟苷酸交换因子GEFs被招募到细胞膜上与RAS结合并释放GDP。由于细胞中GTP的浓度远高于GDP，RAS蛋白迅速结合GTP，招募其下游信号通路的效应蛋白进入“开“的状态。在GAPs（GTPase activating protein）的作用下，RAS的GTPase的活性被提高上千倍，其结合的GTP被水解成GDP，RAS重新进入GDP结合的“关”的状态，从而完成一个完整的循环。

RAS分子开关的结构基础也得到了很好地阐释。RAS蛋白1-166个氨基酸组成G-domain，这个结构域在各亚型中高度保守，余下的23-24个氨基酸组成高度可变区（HVR）。D-domain带有RAS的核苷酸结合口袋，包括P-loop（残基10-17），Switch I（残基30-38）和Switch II（残基60-67）等区域。从其名字可以判断，Switch I 和 II是RAS功能切换的关键。如图3所示，GTP结合的活性状态时，GTP分子中Gamma位磷酸分别与Switch I的T35和Switch II的G60形成氢键，像弹簧一样将它们拉在一起。一旦GTP被水解，Gamma位磷酸被水解掉，Switch I和II被分开，回到GDP结合的非活性构象。

从上述描述可以看出GTP水解是淬灭RAS活性的关键步骤。不难想象，如果基因突变抑制了GTP水解，RAS蛋白将被锁在激活状态。正因为如此，RAS最常见的突变就发生在G12、G13和Q61三个位置。前面提到RAS高效水解GTP需要GAP蛋白参与，GAP与RAS结合后，将一个精氨酸(arginine)残基伸到催化位点，协助水解，这个残基被称作精氨酸手指（arginine finger）。结构生物学研究表明，除了脯氨酸，G12或G13替换成任何氨基酸，立体位阻将阻碍精氨酸手指进入催化位点。Q61则是直接参与水解过程，协助定位一个水分子，稳定水解反应的过渡态。其它突变还有与GDP结合相关的氨基酸如A146。比较有意思的是，虽然各个亚型的D-domain和功能高度类似，但肿瘤中发现的RAS突变主要集中在KRAS(85%)，NRAS(12%)次之，HRAS(3%)最少（图4）。最近的研究也许提供了部分解释，他们发现KRAS4B而不是其它亚型通过HVR区域与calmodulin结合，从而抑制非经典Wnt通路，有利于保持肿瘤细胞的干性状态（4）。

因为这些原因，制药界早期将注意力转移到RAS的高度可变区（HVR）。HVR是RAS用来定位细胞膜的区域，末端包含CAAX系列。RAS蛋白合成后，要进行一系列修饰才能进入细胞膜。CAAX系列的Cys被异戊烯化（prenylation）后，AAX被转化酶RCE1切除，最后Cys的羧基被甲基转移酶ICMT所甲基化。细胞膜定位对于RAS的功能至关重要，其调节蛋白如GEFs、GAPs以及各种效应蛋白都依赖细胞膜移位（translocation）进行调控。让人没想到的是，抑制RCE1和ICMT有时反而促进肿瘤的发生，原因还不太清楚。其实抑制RAS通路的某个环节造成反向激活(paradoxical activation)还比较常见，比如Raf和MEK抑制剂中都发现了类似的现象，这也是RAS药物开发的一个难点。

对于第二个问题，2018年，Wellspring Biosciences的科学家发表了一项详细研究（17）。文章认为G12C抑制剂与传统的共价抑制剂不同，他们与Cys的结合不是亲合力驱动的，而是由化合物与Cys的高反应性驱动的。令人费解的是，这些化合物以及G12C中的Cys，内在的反应性都很低，这也是为什么这类化合物的特异性非常好的原因。那问题是，这个特异的高反应性从哪里来的？晶体结构显示，是因为G12C附近的赖氨酸Lys16质子化后，可以稳定Cys共价反应的过渡态，起到自催化的作用（图6）。另外，由于GTP的gamma位磷酸可以干预Lys16的作用，可能是G12C抑制剂只能作用于GDP结合的RAS的原因之一。比较有意思的是，基于GDP结构设计的，以结合力驱动的G12C共价抑制剂比如SML-8-73-1系列反而没有取得理想的效果（18）。这个案例显示，一个非常浅、动态的临时诱导的结合口袋，虽然无法为小分子提供足够的亲和力，也能通过“高反应性”驱动的共价抑制剂有效抑制，这为小分子共价抑制剂在其它所谓“不可成药”靶点的应用提供了无限的遐想。

RAS抑制剂巨大的商业前景、G12C扎实的基础研究和有说服力的前期数据，在制药界激发了一股开发G12C抑制剂的热潮，几乎每个月都有新的专利公开。进展最快的就是已经公开一期临床数据的安进，Wellspring和Mirati等公司的产品也已进入临床。其它大公司比如Pfizer、AZ都在跟进，国内的fast-follow也是争先恐后。由于篇幅有限，me-too开发和结构改造方面的进展就不在这里赘述。

KRAS G12C抑制剂的初步成功，无疑是令人兴奋的。让人们重新认识了RAS生物学，发现RAS突变不是持续激活，而是“hyperactive”。化学上展示了小分子共价抑制剂既可以通过亲和力驱动，也可以是反应性驱动，为这类药物的应用拓展了空间。但RAS还有太多的未解之谜和挑战，AMG 510的成功只是攻克RAS难题的一小步。即使是G12C抑制剂，还有许多未知的东西，给其开发前景带来不确定性。1）前面已经提到，由于化合物作用于平衡反应，可能需要较大剂量，AMG 510就是在高剂量组效果比较好，这对药物的安全性要求比较高；2）另外，肿瘤进展的各个阶段的DNA分析发现，KRAS变异在肺腺癌和胰腺癌肿瘤内部异质性较小，而在肺鳞癌和肠癌中KRAS变异出现较晚，含有KRAS突变的肿瘤细胞可能只是其中的一个“亚克隆”（19，20）。这预示RAS变异对药物的敏感度可能与肿瘤类型高度有关。AMG 510目前来看在肠癌中的临床效果比较差，似乎验证了这些基础研究的结果；3）分子靶向药物出现耐药被认为是难以避免的。AMG 510作为KRAS直接抑制剂，刚开始临床研究，是不是容易耐药还难以判断。不过，安进公开的临床数据显示，在15周时间内11名PR病人已有2名发生疾病进展，其中1人死亡（图7）。这也许是为什么AMG510一期数据公开后，安进的股票没涨反而是下跌。基础研究给出的信号也不太好。比如，体外试验发现肿瘤细胞对KRAS变异的依赖程度与细胞的生长条件高度相关，3D培养的细胞对G12C抑制剂的敏感程度大于2D培养。这让人担心肿瘤微环境的调整即可轻松摆脱对KRAS的依赖。2014年一篇《Cell》文章的研究显示，胰腺癌细胞通过激活Yap1，可以克服对KRAS依赖（21）；4）还有就是RAS是否存在二聚或者多聚的情况在学术界还有较大争议，但这也可算作机制不明确的风险。RAS通路的RAF蛋白就是通过二聚产生抑制剂诱导的反向激活。

1）首先，考虑靶向其它RAS突变，比如最常见的G12D和G12V。因为这类蛋白缺乏合适的Cys或者其它非天生的可共价结合的氨基酸，要取得足够的活性和选择性比较困难。BI今年8月份报道了一个纳摩尔活性的结合在Switch区域的非共价抑制剂BI-2852（22）。机制上不同于G12C抑制剂，这个化合物可以同时抑制活性和非活性状态RAS，且不限于G12C。令人遗憾的是，细胞测试上活性不高，而且出现了类似于BRAF抑制剂的反向激活的老问题；2）另外，药物联用是克服耐药和提高疗效的一个常用办法。临床前研究表明，KRAS变异对肿瘤免疫疗法比较敏感，特别是P53共变异的病人。AMG510与PD-1单抗联用的临床研究即将展开，让我们拭目以待。KRAS抑制剂与RAS通路上其它药物的联用也值得探索，比如EGFR、BRAF、MEK、PI3K，以及SHP2抑制剂，等等；3）寻找与RAS变异合成致死的药物，最近的例子有XPO1抑制剂和铁死亡诱导剂等；4）随着新技术的发展，人们也将眼光转向了其它非小分子药物形式，比如siRNA（23）、细胞内单抗碎片（24）等。用于RAS蛋白降解的PROTAC也有不少专利公开。这些研究都是很好的尝试，但离真正的临床应用还有很长的路。比较有意思的是，细胞治疗的权威Rosenberg教授最近在《NEJM》上报道了一例针对KRAS G12D的TIL疗法。经过G12D特异和HLA-C*8:02等位基因限制的T细胞治疗，一个50岁的带有肺转移的女性肠癌患者取得了9个月的PR。然而，HLA-C*8:02的广泛性如何还有争议，有专家认为非常罕见。

在新药难觅的今天，RAS直接抑制剂的突破，哪怕是一小步，也让人无比欣慰。中国创新药这两年经历了比较大的起伏，向原创新药转型的呼声日益高涨。KRAS G12C抑制剂的开发也许能给我们稍许启示。基础研究确实是原创新药的基础，但能否，多长时间能导致新药的发现却未可知。RAS从60年代发现，经历了50多年，其中对其生物学有贡献的基础研究数以千计，作为一个潜在的靶点是十分明了的事情，但直到2013年，Shokat实验室才找到了第一个具有成药性的直接抑制剂。Shokat的大胆尝试很重要，但我认为突破的关键是其UCSF同事Wells James教授开发的“Tethering“技术。这个技术2000年发表后，一直默默无闻，看似没有什么用处。这说明药物创新的生态环境多么重要，不是单打独斗可以实现的。从商业的角度上看，Shokat帮助建立的Wellspring公司应该是原创，但是很快被fast-follow的安进公司超越，大概率AMG 510将成为第一个上市的G12C抑制剂。所以，在中国新药研发转型的关键时期，各方应该静下心来做自己擅长的事情，无论是基础研究、me-too还是原创，营造药物创新良好的生态。真正的原创新药可能没有什么路径，也没有什么时间表，事情做好了，就水到渠成了。

谢雨礼博士

谢雨礼博士，苏州偶领生物医药有限公司创始人，总经理，毕业于南开大学化学系，获得中国科学院上海药物研究所的博士学位，在哥伦比亚大学从事博士后研究工作。在美期间，谢博士曾在哥伦比亚大学医学院与默沙东公司合作的联合实验室从事新药研发工作。回国后先后在扬子江药业、日本大冢和药明康德任职，从事立项、研发和项目管理以及运营和市场情报工作。2017年4月份起创业，创办苏州偶领生物医药有限公司，致力于创新化药的研究和开发。