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2021 年诺贝尔生理学或医学奖授予对感知触觉、相关受体家族及其神经转导机制的研究。除鉴别相关编码基因和蛋白功能外，结构生物学对此类离子通道受体复杂门控调节机制的阐明发挥了重要作用，这不得不提到冷冻电子显微（Cryo-EM）成像分析技术的快速发展以及在化学药物开发和新型抗体生物药研发等领域的应用。本文将从 Cryo-EM 单颗粒方法的核心要点及基本理论、实现高分辨率结构解析的具体案例和 Cryo-EM 应用于抗体药物开发的实例进行讲述。 快速冷冻样本制备技术和三维重构算法的提出直接推动了冷冻电子显微镜的发展，并应用于生命科学领域为生物大分子的结构解析带来了前所未有的分辨率提升（见下图），为此 Jacques Dubochet, Joachim Frank 和 Richard Henderson 三位科学家成为 2017 年诺贝尔化学奖得主。
Dubochet 运用了水分子在快速冷冻条件下被固定且不形成冰晶的原理，将含水的生物样品制成薄层状并快速浸入液态乙烷使得样品包埋在薄的玻璃态冰层中，保留了样品的天然结构信息，之后转入液氮中保存或用于透射电镜数据收集的生物样本制备方法，也使得生物样品被电子束照射受到的辐射损伤减小，直接推动了冷冻电镜在生物学领域的应用。
冷冻电镜单颗粒方法实现三维重构的理论主要是基于傅里叶变换和中央截面定理。电子穿过样品到物镜后焦面的过程，实现从实空间到倒易空间的转换（在数学上称为傅里叶变换，Fourier Transform）。发生衍射的电子再穿过中间透镜即完成成像的过程（称为逆傅里叶变换过程）（图1）。 根据中央截面定理，一个三维物体投影像的傅里叶变换等于该物体三维傅里叶变换垂直于该投影方向且过原点的截面（中央截面）。通过冷冻电镜采集到生物大分子各个方向的投影，进行二维傅里叶变换，足够多角度的二维傅里叶变换组成三维傅里叶变换，再进行逆傅里叶变换即获得生物大分子的三维结构（图2）。在冷冻电镜单颗粒方法和三维重构原理方面，Frank作出了卓越的贡献，他提出了对不同取向的单颗粒图像做对齐（alignment）、二维平均（two-dimensional averaging）和分类（classification）等处理的算法，显著提高了颗粒的信噪比，并开发了第一个三维重构的软件Spider。 真正实现冷冻电镜的分辨率革命源于直接电子探测器（Direct detect device, DDD）并结合算法的出现。Herderson 除了提出了冷冻电镜的基本理论，通过漂移矫正算法（Motion correction）进行还原并获得样品高分辨率的结构信息，最终实现高分辨率结构的三维重构。 冷冻电镜单颗粒方法独特的优势在于，相比经典的 XRD 技术，可以跳过对晶体生长这一耗时步骤样品制备量的要求，因此面对如离子通道、超级复合体、具有动态构象态等难以结晶的生物大分子时，冷冻电镜的优势得以完全展现。极大地拓展了结构生物学的应用性。 在看到冷冻电镜对高分辨率结构解析的优势，也不能忽视该方法对操作者的实操经验技巧、数据选择和算法运用及模型选择策略的要求，如
判断样品颗粒的位置取向、对角度空间的覆盖程度、选择收集满足分析需求的数据；
对于抗原-抗体复合物解析，抗原多聚体、糖基化修饰等应作为首先纳入考量的特殊因素。
单颗粒分析（Single particle analysis, SPA）和微电子衍射（Micro-ED）是冷冻电镜常用的分析方法。结合本文作者主导、发表于植物学顶级期刊 Nature Plant 研究项目——光合作用超级复合物三维结构解析的实际案例出发，展示冷冻电镜技术并展望对基于结构的药物研发的应用【1】。
绿藻光系统 II（PSII）是藻类和绿植进行光合作用的必需超分子机器，与捕光复合物 II（LHC II）形成的 PSII-LHCII 复合物捕获和转换光能，本文作者运用冷冻电镜 SPA 技术揭示了衣藻来源的 C2S2 和 C2S2M2L2 型超级复合物的高分辨率冷冻电镜结构（分别为 2.7Å 和 3.4Å ），还发现了二者的装配原理和能量传递途径及其相关功能机制。C2S2M2L2 型复合物也是目前已知最大的植物光系统 II 超级复合物。运用晶体学解析膜蛋白尤其是超大复合体的结构一直是个难点，实现晶体的生长对样品本身性质要求极高，即使最终拿到高分辨率衍射数据也是时间周期长且需要反复优化的过程。而冷冻电镜是更好且成功的途径。该研究中，作者对绿藻细胞进行了破碎操作，经过类囊体分离、密度梯度、超速离心等步骤获得目的复合物后，绕过了结晶阶段，可直接取少量且低浓度的蛋白溶液用于冷冻样本的制备，通过冷冻样品的优化，收集一套或多套单颗粒数据集解析了超级复合物的高分辨率结构。这是 XRD 及其它生物物理方法无法做到的。
蛋白质的结构决定功能，解析蛋白质（复合物）的高精度结构在药物研发中扮演了关键的作用，近年来，随着结构生物学方法尤其是冷冻电镜的蓬勃发展，基于结构的药物研发逐渐成为了热门的领域。近日，来自北京大学的研究人员通过冷冻电镜单颗粒方法揭示了 II 型糖尿病口服药物恩格列净与其作用受体葡萄糖转运体 SGLT2 间的三维结构（分辨率为 2.95Å ），研究结果发表在 Nature 杂志【2】，该工作首次明确了 SGLT2 抑制剂的关键结合位点，阐释了药物发挥抑制作用的分子机制，为 SGLT 家族新一代抑制剂的开发提供了坚实的结构基础和优化方向。
结构信息的重要性不仅体现在小分子化药的开发，在治疗性抗体药物开发中，基于抗原表位-抗体复合物结构结合计算机模拟和预测的方法，越来越受到研发人员的认可和青睐。目前，部分大型药企已经布局基于冷冻电镜的三维结构解析平台以指导抗体药物开发。
Sanofi 用于抗体开发的整合结构生物学研究流程图【3】
根据靶标蛋白的分子量选择更加合适的生物物理方法，一般分子量在 50kDa 及以上可选择冷冻电镜单颗粒方法进行结构解析。在进行三维重构时根据分辨率不同也有对应的策略。如当密度图分辨率低于 4Å 的情形下不足以搭建精确的结构模型，可借助分子动力学模拟的方法对关键的结合部位进行计算，最终获得出抗原-抗体的相互作用模式，并进一步补充和精确结构模型。 可见以结构为基础，结构生物学、高精度计算化学和AI算法预测等学科的融合，将为抗体药物亲和力成熟、成药性改造、表位研究、作用机制的解析及工程化改造等开发提供扎实的结构基础和可靠的保障。
参考文献
Sheng X. et al. Nat. Plants5, 1320-1330 (2019)
Niu Y. et al. Nature (2021) https://doi.org/10.1038/s41586-021-04212-9
Yuri L. et al. AntibodyTherapeutics (4) 242-251 (2021)
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